藥物研究人員反復(fù)做著一個(gè)噩夢：他們花費(fèi)數(shù)年和數(shù)十億美元研發(fā)了一個(gè)新藥，小心翼翼地通過臨床前和臨床試驗(yàn)，最終獲得政府的許可，得以面向患者。突然，這種藥物組分開始傷害那些本該獲得幫助的人。一項(xiàng)新療法的未來瞬間崩塌，他們又陷入了失去研究資助和訴訟的困境中。
“如果你回首過去的10到12年，這些事情都在不斷地發(fā)生，每年都有一些藥物順利進(jìn)入（市場），但卻被迫召回或者大幅減少使用。”位于英國卡迪夫的GE Healthcare 公司生命科學(xué)部門首席科學(xué)家Stephen Minger說。
這一問題來源于毒理學(xué)分析的缺陷。在標(biāo)準(zhǔn)的藥物獲準(zhǔn)過程中，研究人員在動(dòng)物和相對少部分人群中檢測藥物的毒性。動(dòng)物模型并不能準(zhǔn)確地代表人類的生理機(jī)能，并且臨床試驗(yàn)也很少能囊括體量足夠的群體來鑒定罕見的特異體質(zhì)的影響。
最理想的解決方案是將真正的人類組織和器官在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)，來模擬大量患者群體的生理機(jī)能，避免大規(guī)模臨床試驗(yàn)所帶來的成本和道德包袱。通過胚胎和最新的人類干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，毒理學(xué)家和細(xì)胞生物學(xué)家正在著手推動(dòng)這項(xiàng)工作。
心臟技術(shù)
傳統(tǒng)上而言，毒理學(xué)家能夠檢測永生化細(xì)胞系和原代組織培養(yǎng)中的組分。永生化細(xì)胞系是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)有效的腫瘤細(xì)胞，僅與機(jī)體中的細(xì)胞有一點(diǎn)相似。原代培養(yǎng)物可以更加逼真地代表組織的正常生理狀態(tài)，但存活時(shí)間卻無法滿足延伸實(shí)驗(yàn)。
干細(xì)胞結(jié)合了這兩種培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，能夠持續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，并且能夠誘導(dǎo)分化成各種實(shí)際的組織。大約5年前，Minger和同事開始探索這些特性，用于研發(fā)藥物毒性的新分析方法。“我們將人類胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)變成大量的成人心肌細(xì)胞，并且我們和客戶都可以完全對其進(jìn)行預(yù)測。”Minger接著說，“至少在回顧性的分析中，我們能夠在（美國）食品藥品監(jiān)督管理局的召回藥中發(fā)現(xiàn)毒性成分，這之前（的傳統(tǒng)分析中）卻沒發(fā)現(xiàn)一點(diǎn)毒性。”一些制藥公司在研發(fā)過程中開始使用GE公司的Cytiva心肌細(xì)胞分析法來檢測藥物。
其它公司也開始研發(fā)基于干細(xì)胞的心肌毒性分析法。例如，位于美國威斯康辛州麥迪遜市的Cellular Dynamics 公司，提供了一種在誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem，iPS）中獲得的iCell競爭性心肌細(xì)胞系。不同于胚胎干細(xì)胞，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞來源于成年志愿者。生長因子的組合將成人細(xì)胞變成了一種類似胚胎的狀態(tài)，這樣就能指導(dǎo)其分化成所有主要的組織類型。
對于想要自己研發(fā)干細(xì)胞分析法的研究人員來說，可選擇的試劑非常多。如今，常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室供應(yīng)公司都提供干細(xì)胞培養(yǎng)基，法國巴黎的Cellectis公司和英屬哥倫比亞溫哥華市的Stem Cell Technologies公司等專業(yè)型公司也涉足這一領(lǐng)域。無論選擇何種路徑，分析法的研發(fā)人員都必須解決一些問題，才能研發(fā)出有效的毒理學(xué)工具。盡管很多將干細(xì)胞分化為特定組織的步驟都似乎夠直接，得出的細(xì)胞卻往往會(huì)處于非成熟狀態(tài)，并且與部分分化的母細(xì)胞混在一起。
制藥研究的分析也必須保持一致，這也是干細(xì)胞領(lǐng)域的一大主要挑戰(zhàn)。“我們用于產(chǎn)生（干）細(xì)胞的大量試劑都眾所周知的易變。”Minger說。為了解決這些問題，他的團(tuán)隊(duì)將心肌細(xì)胞分化的過程分成了單個(gè)步驟，然后分離和控制盡可能多的變異。結(jié)果形成了一條生產(chǎn)線，產(chǎn)生的培養(yǎng)物能夠保證至少50%的細(xì)胞是成熟的心肌細(xì)胞。
藥物與發(fā)展
基于干細(xì)胞固有的生物學(xué)特性，產(chǎn)生完全成熟的成人細(xì)胞未來仍有可能是一大挑戰(zhàn)。“干細(xì)胞??實(shí)際是為了更好地形成胚胎，并為生命的最初嘗試建造機(jī)體。”美國康涅狄格州格羅頓市輝瑞公司高級(jí)研究員Robert Chapin說。然而，對于研究發(fā)育毒性的Chapin和他的同事而言，干細(xì)胞衍生組織的不成熟性是一種特性而非缺陷。
實(shí)際上，對于確定組分是否對發(fā)育中的胎兒具有毒性來說，干細(xì)胞系統(tǒng)應(yīng)該說是近乎理想的系統(tǒng)，特別是如果研究人員能將多個(gè)組織的生物學(xué)特性融入到單個(gè)培養(yǎng)物中。“其中一個(gè)（目標(biāo)）是將來源于干細(xì)胞的多種細(xì)胞型放入3-D培養(yǎng)物中，這是因?yàn)檫@些細(xì)胞無法分開操作。”輝瑞公司高級(jí)首席科學(xué)家Donald Stedman說。
輝瑞公司目前已將自己基于鼠源干細(xì)胞的檢測融入到其藥物研發(fā)流程，檢測發(fā)育毒性。監(jiān)管部門十分依賴于小鼠和家兔的臨床前數(shù)據(jù)，以預(yù)測藥物對于人類的發(fā)育影響，而不是堅(jiān)持對孕婦進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)。對于小鼠胚胎有毒的藥物是不會(huì)得到批準(zhǔn)用于孕婦的，因此公司就想要清除可能在小鼠中失敗的組分。
為了核實(shí)這一分析方法，Chapin的團(tuán)隊(duì)檢測了之前在動(dòng)物身上研究過的超過90種組分，這一團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞分析和真實(shí)的發(fā)育毒性結(jié)果存在近乎完美的一致性。“我們使用一種干細(xì)胞分析，幫助我們鑒定那些明確具有毒性、明顯不需要再繼續(xù)推進(jìn)的組分，如果我們夠幸運(yùn)，通過這一方法檢驗(yàn)一個(gè)未知的組分，并得到清晰的結(jié)果，那么就可以輕松給予它良好的健康證明書。”Chapin說。
這種極端的結(jié)果與其說是規(guī)則，不如說是例外。更普遍的是，調(diào)查者發(fā)現(xiàn)新的組分在一定劑量下表現(xiàn)出一定的毒性。“在實(shí)際情況下，我們最后需要做出判斷，并且討論概率。”Chapin解釋說。
缺乏經(jīng)驗(yàn)和概率性的干細(xì)胞分析結(jié)果推遲了它們的應(yīng)用。“我得說，在制藥商的群體中（基于干細(xì)胞的分析）有相當(dāng)大的阻力，因?yàn)樗麄儾淮_定（這種技術(shù)）正在告訴他們什么。”GE公司的Minger表示。例如，他接著說，“如果你看到一個(gè)組分在我們的（Cytiva）細(xì)胞上是有毒的，但在其它所有標(biāo)準(zhǔn)測試中都是無毒的，你該相信誰？”
干細(xì)胞分析的早期支持者確信，隨著更多數(shù)據(jù)的出現(xiàn)，這些擔(dān)憂會(huì)逐漸消退。研究人員也可能會(huì)因?yàn)楦杉?xì)胞分析的獨(dú)特性能而改變想法，例如更直接地檢測人類的發(fā)育毒性。“我希望在發(fā)育毒性方面，可以研發(fā)出使用人類胚胎干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)測的分析方法，那樣我們就能判斷出，比起我們使用的（動(dòng)物）系統(tǒng)來說，這種方法具有更高或更低的價(jià)值。”Stedman說。
團(tuán)隊(duì)努力
在歐洲，使用干細(xì)胞替代動(dòng)物檢測也很風(fēng)靡。2011年，歐盟委員會(huì)和一個(gè)化妝品制造商聯(lián)盟聯(lián)合資助了一個(gè)安全評價(jià)最終替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（Safety Evaluation Ultimately Replacing Animal Testing，SEURAT）的項(xiàng)目，這一項(xiàng)目包含了若干個(gè)大的研究計(jì)劃，旨在制定化妝品和其它化學(xué)品的替代性安全檢測。同時(shí)，歐洲當(dāng)局也開始限制動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，最終于2013年3月通過了一項(xiàng)全歐洲的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)化妝品銷售禁令。
在SEURAT的群體中，相關(guān)、高效和標(biāo)準(zhǔn)化的毒理學(xué)干細(xì)胞研究計(jì)劃（Stem Cells for Relevant, Efficient, and Normalized Toxicology，SCR&Tox）完全聚焦于研發(fā)基于干細(xì)胞的毒性檢測方法，共有五種組織類型：心臟、肝臟、肌肉、皮膚和神經(jīng)。盡管SEURAT計(jì)劃由化妝品公司資助，制藥研究人員也會(huì)發(fā)現(xiàn)，許多SCR&Tox的檢測方法也適用于他們。“SEURAT項(xiàng)目集群的目標(biāo)是替代活體內(nèi)重復(fù)劑量的毒性檢測。”SCR&Tox的項(xiàng)目經(jīng)理Vania Rosas說。
為此，SCR&Tox項(xiàng)目研究者一直致力于將誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS）分化至項(xiàng)目所研究的5個(gè)成熟的組織類型。Rosas說，他們遇到了許多其他研究者具有的相同問題，尤其是干細(xì)胞即使經(jīng)過分化后，仍然趨向于保持非成熟的特性。盡管如此，SCR&Tox研發(fā)的檢測方法將很快找到它們的方式，以入主用于檢測和確證的工業(yè)實(shí)驗(yàn)室，Rosas希望監(jiān)管機(jī)構(gòu)能夠在幾年內(nèi)開始接受基于干細(xì)胞的化妝品毒性數(shù)據(jù)。
另一項(xiàng)大規(guī)模的歐洲研究計(jì)劃StemBANCC也致力于提高毒理學(xué)分析中的干細(xì)胞使用。就在SCR&Tox的研究人員研發(fā)基于健康志愿者身上提取的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的通用毒理檢測方法時(shí)，StemBANCC的科學(xué)家則聚焦于來源于500個(gè)患有各種疾病的患者身上的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。這些疾病特異性的細(xì)胞將形成新一代藥物研發(fā)分析的基礎(chǔ)，包括毒理學(xué)檢測。
“新一代的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞還只是一項(xiàng)技術(shù)目標(biāo)。更重要的（是）將它們分化成與疾病相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)??隨后試著在培養(yǎng)皿中理解這個(gè)疾病。”瑞典巴賽爾Hoffmann-La Roche公司的干細(xì)胞平臺(tái)負(fù)責(zé)人Martin Graf說，他也是StemBANCC項(xiàng)目的負(fù)責(zé)人之一。
除了細(xì)胞樣品外，StemBANCC項(xiàng)目也將從病例中收集詳細(xì)的臨床數(shù)據(jù)。“這一計(jì)劃的其中一件大事是臨床表型的深度，這是我們將要在病人身上操作的。我覺得隨后細(xì)胞系的真正價(jià)值是得到表型信息。”StemBANCC的學(xué)術(shù)主任、英國牛津大學(xué)Nuffield學(xué)院臨床神經(jīng)科學(xué)教授ZameelCader說。除了診斷和歷史外，每個(gè)StemBANCC生產(chǎn)線都將伴隨著診斷檢測帶來大量的數(shù)據(jù)，體現(xiàn)病人的病程、治療手段和藥物反應(yīng)。
最終，該計(jì)劃尋求為制藥研究人員提供真實(shí)的個(gè)體病人的實(shí)驗(yàn)室模型，在新藥到達(dá)臨床前就能得到針對有效性和毒性的更可靠預(yù)測。“我認(rèn)為使用源于病人材料的體外毒理學(xué)確實(shí)是試著解決藥物研發(fā)過程中藥物脫靶的第一步。”Cader說。
芯片上的大腦
其他研究者正在將“培養(yǎng)皿中的病人”這一概念更進(jìn)一步，試著在類似器官的3-D培養(yǎng)物中讓多種組織類型生長在一起。瑞士貝爾蒙的西瑞士應(yīng)用科學(xué)大學(xué)組織工程學(xué)教授Luc Stoppini最初在對傳統(tǒng)干細(xì)胞培養(yǎng)失望后，開始了這一研究計(jì)劃。“他們宣稱得到了（干細(xì)胞誘導(dǎo)的）神經(jīng)元，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)的beta-3微管蛋白基因是神經(jīng)元的標(biāo)記之一，但當(dāng)我看到它們時(shí)，它們就像成纖維細(xì)胞，不具有分化的軸突、神經(jīng)突起和突觸。”Stoppini說。
作為神經(jīng)生物學(xué)家，Stoppini想要更加真實(shí)的神經(jīng)系統(tǒng)。讓干細(xì)胞誘導(dǎo)的“神經(jīng)元”長在3-D的培養(yǎng)系統(tǒng)中，將引導(dǎo)它們發(fā)育出更多的神經(jīng)元形態(tài)，細(xì)胞也開始能夠傳導(dǎo)電信號(hào)。竅門在于讓3-D培養(yǎng)比傳統(tǒng)平板培養(yǎng)長得更長（神經(jīng)元通常在幾個(gè)月內(nèi)持續(xù)發(fā)育）。“我們確實(shí)需要時(shí)間去得到人類神經(jīng)元的功能。”Stoppini說。他接著表示這一緩慢的發(fā)育會(huì)使得等比擴(kuò)大某些分析，以達(dá)到制藥公司的高通量需求變得十分困難。
然而，讓這一系統(tǒng)發(fā)揮作用的回報(bào)也可能很大。特別是，Stoppini說，長期的培養(yǎng)能夠發(fā)育出一些非神經(jīng)的細(xì)胞型，它們對于正常神經(jīng)系統(tǒng)的功能來說也是尤為重要的，例如星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突細(xì)胞。他的團(tuán)隊(duì)現(xiàn)在從胚胎細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞中都能得到這些小型的腦組織，從而提高了模擬來自于患者細(xì)胞的特定神經(jīng)疾病的可行性。
研究人員也將這一步驟繼續(xù)向前推進(jìn)，將3-D腦培養(yǎng)物長在點(diǎn)滿了電子感應(yīng)器的微流控芯片上。當(dāng)感應(yīng)器記錄電活動(dòng)的時(shí)候，微毛細(xì)管就為培養(yǎng)物帶來了新鮮的營養(yǎng)。
Stoppini也將腦芯片與其他干細(xì)胞誘導(dǎo)的微流控器官培養(yǎng)物交聯(lián)。未來的藥物研究者能夠?qū)?shí)驗(yàn)藥物喂飼進(jìn)源于患者的腸子中，然后通過血管系統(tǒng)將它的代謝物傳遞到微型的肝臟中，最終影響體外大腦的活性。“我們的終極期望是得到我們稱為21世紀(jì)的培養(yǎng)皿，它將具有嵌入在生物芯片中的培養(yǎng)物，在那兒所有的生物傳感器??都整合在一起。”Stoppini說。
該技術(shù)最新的循環(huán)也引入了無線局域網(wǎng)的發(fā)射器，這樣研究人員不用打開孵化器就能監(jiān)測系統(tǒng)。Stoppini接著說，“這是一個(gè)不尋常的時(shí)期，它通過整合生物學(xué)工具（和電子學(xué)），打開了新的研究途徑??因此我們能夠真正地瞥見這些事物是如何工作的。”
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