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Elisa標(biāo)準(zhǔn)操作及常見問題分析
一.Elisa 標(biāo)準(zhǔn)操作要點(diǎn)
優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證Elisa 檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。Elisa 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的本公司要求使用的純化水電導(dǎo)率小于1.5μs/cm。
1. 標(biāo)本的采取和保存
大部分Elisa 檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP 為標(biāo)記的ELISA 測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。一般說來，在5 天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致血清IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測(cè)定的需－20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。
抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。
2.加樣
加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。
3.保溫
在建立ELISA 方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2 小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會(huì)造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應(yīng)，邊上的值會(huì)偏高，建議為了客觀的判斷結(jié)果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。
4.洗滌
洗滌在ELISA 過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA 操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。
洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。
洗板時(shí)注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應(yīng)按要求稀釋，所用的水電導(dǎo)率最好在1.5us/cm 之下，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制。保證洗板浸泡時(shí)間為40 秒左右，孔內(nèi)液體被洗板機(jī)吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。
5. 顯色和比色
TMB 經(jīng)HRP 作用后，約40 分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2 小時(shí)后即可完全消退至無色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長(zhǎng)時(shí)間（12-24 小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)（450nm）測(cè)讀吸光值。酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指專用于測(cè)讀ELISA 結(jié)果吸光度的光度計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在15~30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30 分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。
測(cè)讀A 值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀，即每孔先后測(cè)讀兩次，第一次在最適波長(zhǎng)（W1），第二次在不敏感波長(zhǎng)（W2），兩次測(cè)定間不 移動(dòng)ELISA 板的位置，最終測(cè)得的A 值為兩者之差（W1-W2）。雙波長(zhǎng)式測(cè)讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
二.本底及假陽性產(chǎn)生的原因分析
1. 基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別
1.1 基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達(dá)系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)：
a.分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。
b.穩(wěn)定性好。包被的抗原的穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的試劑盒效期只有3-4 個(gè)月，采用基因工程抗原后效期大大延長(zhǎng)了。
c.基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。
d.純化難度大。基因工程抗原的純化技術(shù)難度較大。
1.2 合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點(diǎn)：
a.分子量太小
b.一般只含有一個(gè)抗原決定簇
c.純度高
d.穩(wěn)定性差
由于基因工程抗原較于合成肽抗原有無可比擬的優(yōu)越性，ELISA 診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。就HCV ELISA 試劑盒來講，第一代產(chǎn)品為合成肽抗原，主要是HCV 特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當(dāng)時(shí)的基因工程抗原不全，僅包括了HCV 的核心區(qū)片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCV 特異性抗原。第三代試劑的敏感度大大提高了。
由于歷史的原因，人們往往以反應(yīng)本底的好壞來衡量ELISA 反應(yīng)試劑盒，因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學(xué)敏感度不夠，穩(wěn)定性也成問題。值得欣慰的是也有廠家堅(jiān)持試劑盒高的流行病學(xué)敏感度，科學(xué)得對(duì)待反應(yīng)結(jié)果。
2．假陽性本底產(chǎn)生的原因
2. 1 抗原因素
2.1. 1 融合蛋白對(duì)基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷試劑盒為例為例，因?yàn)榘坏幕蚬こ炭乖瓰槿诤系鞍祝藖碜员磉_(dá)載體的一些序列，因此可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生了可疑標(biāo)本。 |
