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細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法作為控制藥品質(zhì)量的一種有效方法，已經(jīng)廣泛的被世界各國藥典收載。經(jīng)過30多年的不斷改進(jìn)，無論是凝膠法還是光度法均比較成熟和完善。但是，在為新化合物或新藥建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法時，常常會遇到各種各樣的困難，尤其是尚處于新藥研發(fā)早期階段的藥物，由于藥物制劑、賦形劑等還不穩(wěn)定，經(jīng)常會發(fā)生變化，這樣就給方法的建立帶來不同程度的影響。在建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法之前，應(yīng)盡可能多的收集有關(guān)該藥品的基本信息，例如：有關(guān)樣品的溶解性信息，推薦的稀釋液，在水中的溶解度，以及最適溶劑；樣品的pH范圍；分子量大小；產(chǎn)品規(guī)格、體積或重量；擬用于臨床的用法和用量等等。以便選擇合適的樣品處理方法和內(nèi)毒素檢查方法，對于早期研發(fā)階段的藥物，應(yīng)選擇合適的賦形劑，以有利于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中對樣品的稀釋處理。此外，在確定內(nèi)毒素限值時還應(yīng)盡可能采用最大人擬用劑量，為臨床安全性和有效性研究中增加劑量留出空間。
一、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法建立的主要步驟
對某一新化合物建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法時，首先應(yīng)根據(jù)人體最大日給藥劑量和給藥途徑，計算和確定樣品的內(nèi)毒素限值，選擇合適的鱟試劑，根據(jù)臨床規(guī)格，計算最大有效稀釋倍數(shù)，稀釋產(chǎn)品，并在低于最大稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行檢查。可以采用凝膠法，也可以采用終點法或動態(tài)法。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法為準(zhǔn)。
1、細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定
一個藥品在投放市場前，它是否滿足內(nèi)毒素限值的要求？樣品的內(nèi)毒素含量具體是多少？這些問題不但關(guān)注用藥安全，還應(yīng)該最大限度的提供有關(guān)內(nèi)毒素含量的準(zhǔn)確信息，為藥品生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制提供警戒信息。盡管細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立是一個科學(xué)方法的研究過程，但其最終目的還是要為控制藥品質(zhì)量服務(wù)。因此，在方法建立時，不但要闡明限值的合理性，考慮技術(shù)可能達(dá)到的限值，同時還要滿足相關(guān)藥品管理法規(guī)的要求。
研究人員在建立方法的早期，一般會按照臨床建議的最大人用劑量確定一個非正式的限值，這個限值可以根據(jù)實驗室可以達(dá)到的最低檢測水平，把限值訂的相對比較嚴(yán)格，但往往由于早期的臨床劑量會比最終上市的臨床劑量高幾倍，所以嚴(yán)格的限值，可能會使得正式生產(chǎn)時很多產(chǎn)品不能通過檢查，從而造成不必要的浪費；因此參按照法規(guī)允許的最高水平，酌情確定樣品的限值。
樣品內(nèi)毒素限值的確定一般與臨床人體最大給藥劑量有關(guān)，劑量越大，單位重量或體積的內(nèi)毒素限值越低。一般按以下公式計算：內(nèi)毒素限值L=K/M。式中內(nèi)毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；K為按規(guī)定的給藥途徑，人體每公斤體重每小時最大可耐受的內(nèi)毒素劑量，以EU/（kg.h）表示，注射劑K=5EU/（kg.h），其中放射性藥品注射劑K=2.5EU/（kg.h），鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/（kg.h）。一般我國人群平均體重按60kg計算，人體對細(xì)菌內(nèi)毒素的最大耐受量為300EU/h；另我國人體的平均體表面積按1.55m2計算，人體每平方米的最大耐受劑量為(300EU/h)/ 1.55m2 =（193EU/h）/ m2 。 M為人體每公斤體重每小時接受的最大給藥劑量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或u/（kg.h）表示。
內(nèi)毒素限值計算舉例（一）：A注射劑的人體最大用量為每小時1.5g，每公斤每小時體重的劑量為1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg，內(nèi)毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/( 25mg/kg ) = 0.2EU/mg。在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中，細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和鱟試劑常常以EU/ml表示，所以在具體實驗中樣品的內(nèi)毒素的限量可以轉(zhuǎn)換為EU/ml的表示方法，可使實驗操作計算更為方便。假定產(chǎn)品A的濃度為100mg/ml（或原料藥經(jīng)溶解后的濃度為100mg/ml）, 那么，將產(chǎn)品A的限值從EU/mg轉(zhuǎn)變?yōu)镋U/ml時，內(nèi)毒素限值L= 0.2 EU/mg 100 mg/ml = 20 EU/ml。
內(nèi)毒素限值計算舉例（二）：B注射劑的臨床最大用藥劑量為1g/m2，規(guī)格為50mg/ml，內(nèi)毒素限值L=（193 EU/ m2）/（1g/m2）=193 EU/g=0.193 EU/mg，轉(zhuǎn)換為EU/ml 表示時，L = 0.193 EU/mg50 mg/ml=9.65EU/ml。
大輸液品種的限值一般定為0.5EU/ml，滅菌注射用水則定為0.25EU/ml。內(nèi)毒素限值沒有考慮到幾個藥物聯(lián)合用藥問題，但一般情況下，藥品中內(nèi)毒素的含量遠(yuǎn)低于限值，并且藥品生產(chǎn)廠家的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)于注冊標(biāo)準(zhǔn)，所以藥典內(nèi)毒素限值也被稱為最大允許內(nèi)毒素濃度（Maximum allowable endotoxin concentration）。
2、樣品最大有效稀釋倍數(shù)或最小有效濃度的計算
最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)是指在所選擇的鱟試劑靈敏度條件下，對產(chǎn)品進(jìn)行最大倍數(shù)的稀釋，仍能夠進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測，此時所允許稀釋的最大倍數(shù)。 MVD的計算公式為：當(dāng)被規(guī)定的內(nèi)毒素的限值以體積表示時， MVD=內(nèi)毒素限值L（EU/ml ）/鱟試劑靈敏度（λ）；當(dāng)內(nèi)毒素的限值以重量或藥品的生物活性(EU/mg或EU/u)表示時， MVD=內(nèi)毒素限值L（EU/mg 或 EU/u）×供試品溶液的濃度C/ 鱟試劑靈敏度(λ)。在凝膠法中， λ=鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml），在濁度法或顯色法中, λ=所使用標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低點的內(nèi)毒素濃度（EU/ml）。
最小有效濃度（MVC）是指在所選擇的鱟試劑靈敏度條件下，將產(chǎn)品稀釋到一定濃度，仍能夠進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測，此時所允許的最小濃度。計算MVC的一般公式為：MVC=鱟試劑靈敏度（λ）/內(nèi)毒素限值（L）。對所選定的鱟試劑靈敏度來講，MVC是一個絕對值；而MVD對特定的產(chǎn)品濃度是特異的，濃度變化時，MVD也會隨之發(fā)生變化。
3、方法學(xué)驗證試驗的預(yù)試驗
確定了樣品的內(nèi)毒素限值，考察了樣品的溶解性，并且選定了一定靈敏度的鱟試劑，此時便可以考慮進(jìn)行預(yù)試驗。盡管法規(guī)中并不要求進(jìn)行預(yù)試驗，但在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的建立過程中，一般需要進(jìn)行預(yù)試驗。預(yù)試驗的主要目的是確定不出現(xiàn)干擾的第一個樣品稀釋度，也就是不干擾濃度（non-interfering concentration, NIC），為后續(xù)的驗證試驗選擇適當(dāng)?shù)臉悠废♂尪龋ɑ驖舛龋?br />
不管采用凝膠法還是光度法，預(yù)試驗都是對一系列樣品的稀釋液進(jìn)行試驗，在每一個稀釋濃度，都有一組添加內(nèi)毒素的樣品和一組不添加內(nèi)毒素的樣品，添加內(nèi)毒素的濃度保持不變，而樣品濃度會逐級稀釋，但最終樣品的稀釋倍數(shù)不得超過MVD。可以采用直接把內(nèi)毒素添加到樣品溶液中，添加內(nèi)毒素的體積宜小，以免導(dǎo)致樣品溶液被稀釋，一般添加體積等于或小于樣品體積的10%為宜；也可以采用下述方法添加內(nèi)毒素，就是將兩倍于終濃度的內(nèi)毒素溶液與兩倍于終濃度的樣品溶液等體積混合，內(nèi)毒素和樣品溶液間相互稀釋，得到兩者所需終濃度的混合液。添加內(nèi)毒素的濃度，凝膠法為2λ；終點顯色法為4λ（這里的λ表示標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低點，也就是方法的檢測限）。動態(tài)顯色法則有3種選擇添加內(nèi)毒素濃度的方法，可以選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點濃度，也可以與終點比色法一樣，選擇4λ。此外，當(dāng)樣品稀釋液中，內(nèi)毒素的限值小于或等于1.0EU/ml時，添加內(nèi)毒素的濃度可定為0.1-0.5EU/ml之間，當(dāng)樣品稀釋液中，內(nèi)毒素的限值大于或等于1.0EU/ml時，添加內(nèi)毒素的濃度可定為1.0-5.0EU/ml之間。
對于凝膠法的結(jié)果判斷，不添加內(nèi)毒素的樣品不應(yīng)該凝集，如果發(fā)生凝集說明含有內(nèi)毒素或內(nèi)毒素樣物質(zhì)；添加有內(nèi)毒素的樣品應(yīng)該出現(xiàn)凝集，若沒有發(fā)生凝集表明樣品凝集反應(yīng)被抑制。光度法的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為，測得的添加內(nèi)毒素的量應(yīng)該在已知添加量的±50%范圍內(nèi)，超出范圍（多或少）表明存在增強(qiáng)或抑制作用。
通過預(yù)試驗結(jié)果可以確定驗證試驗中樣品的稀釋度或濃度，其選擇的基本原則包括：經(jīng)稀釋后的樣品含內(nèi)毒素的量應(yīng)盡可能少，比其內(nèi)毒素限值至少少4倍，最好檢測不到內(nèi)毒素。要求驗證試驗選擇的稀釋度至少要比NIC大1-2倍，但不可超過MVD。若樣品需要多支合并進(jìn)行驗證試驗，此時試驗不可采用原來的MVD，因為假定合并樣品中有一瓶存在污染，其它瓶沒有污染，污染瓶含有的內(nèi)毒素就會被其它沒有污染瓶樣品所稀釋，并低于MVD，從而檢測不到污染的樣品。因此，采用合并樣品進(jìn)行試驗時，MVD應(yīng)降低，這種情況下的MVD等于原來的MVD除以合并樣品的數(shù)量。
例如：假定鱟試劑的標(biāo)示靈敏度λ為0.125EU/ml，樣品的MVD為100（倍）。
4、方法學(xué)驗證試驗（增強(qiáng)/抑制試驗）
驗證試驗在細(xì)菌內(nèi)毒素方法學(xué)的建立過程中具有十分重要的作用，主要目的是確證檢測內(nèi)毒素的方法是否受樣品的干擾。驗證試驗的特點是樣品濃度保持不變，添加內(nèi)毒素的濃度逐漸降低。在建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法中，驗證試驗前，要去除樣品可能含有的內(nèi)毒素，以確保建立方法的準(zhǔn)確可靠。凝膠法的驗證試驗是通過在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和樣品溶液中平行進(jìn)行鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗完成，試驗中要求樣品平行4管，設(shè)立樣品陰性對照管，也同樣平行4管。盡管要求添加內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)平行管數(shù)量各國不完全一致，可以2管，也可以4管，但鑒于目前國內(nèi)的具體情況，在2005年版藥典附錄的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中規(guī)定是平行4管。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和樣品溶液中的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)平均值（內(nèi)毒素含量）必須在鱟試劑標(biāo)示靈敏度的2倍范圍以內(nèi)，在樣品溶液和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水中的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)平均值也應(yīng)相互在2倍范圍之內(nèi)（2λ-0.5λ）。光度法的驗證試驗中，要求陰性對照所含有的內(nèi)毒素必須明顯低于標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素曲線中的最小濃度，陽性對照的內(nèi)毒素回收率，在扣除樣品可能含有的內(nèi)源性內(nèi)毒素后，必須在已知添加內(nèi)毒素量的50%～200%之間，添加和未添加內(nèi)毒素的樣品管數(shù)量至少要平行2管。
二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法建立時注意事項及常見問題
1、在方法建立的過程中，對方法的驗證非常重要
一個全面可靠的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法學(xué)驗證試驗一般應(yīng)注意：首先要了解產(chǎn)品的溶解度，按照適當(dāng)?shù)呐R床用量確定合適的內(nèi)毒素限值，并確證產(chǎn)品對方法是否存在干擾，如果在樣品處理過程中運用了激烈的處理條件或溶劑，還應(yīng)證明所采用方法不會破壞或減少樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量。其次應(yīng)考察樣品批與批之間的差異是否會引起方法學(xué)變異。此外，還應(yīng)注意實驗中涉及到的試驗器材對方法學(xué)的影響，如：器皿的控制、鱟試劑標(biāo)示靈敏度（或光度法檢測用鱟試劑的檢測限）等。最后，要確保儀器的運行狀態(tài)和對實驗過程的準(zhǔn)確記錄。總之，只有驗證了整個實驗的每一個環(huán)節(jié)，才能保證方法學(xué)的可靠和成功。方法學(xué)驗證終究是為藥品生產(chǎn)質(zhì)量服務(wù)的，驗證本身也是一個動態(tài)的過程，是隨著生產(chǎn)工藝、環(huán)境和檢驗條件改變而變化的。方法學(xué)驗證實驗記錄，要抓住要點，將試驗關(guān)鍵步驟記錄詳細(xì)，避免驗證資料照抄藥典附錄，羅列一大堆規(guī)定，最終沒有明確的方法及可操作性。
2、內(nèi)毒素限值的確定十分關(guān)鍵
在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立中，計算內(nèi)毒素限值L、MVD和MVC時，需要注意最大人用劑量、產(chǎn)品規(guī)格、鱟試劑的靈敏度等重要的參數(shù)，因為計算錯誤會導(dǎo)致后續(xù)的所有努力均告失敗。常見的問題有：（1）臨床用藥劑量確定不正確，僅用常規(guī)用藥劑量，未考慮臨床可能的人體最大用藥劑量和給藥途徑，在限值計算公式L=K/M中，由于對K值及M值的定義模糊，使K值及M值賦值不準(zhǔn)確，最終導(dǎo)致限值計算錯誤。例如，某注射劑臨床成人每次靜脈滴注給藥40～80mg，嬰兒（三個月以上）靜脈滴注給藥每次10～20mg。按成人（體重60kg）劑量計算限值為3.75EU/mg，而嬰兒體重僅為5kg左右，計算限值約為1.25EU/mg，如果不考慮臨床每公斤體重最大用藥劑量，細(xì)菌內(nèi)毒素限值就會出現(xiàn)較大的差別。（2）有的申報品種細(xì)菌內(nèi)毒素限值不是根據(jù)臨床用量計算出來，而是根據(jù)同品種熱原檢查的劑量推算出來的，造成限值錯誤。（3）有的品種細(xì)菌內(nèi)毒素限值從國外藥典抄來，沒有考慮該品種國內(nèi)上市的臨床使用劑量及中國人與國外人均體重等的差異，也造成限值確定不正確。（4）錯誤的計算日給藥劑量（一日內(nèi)多次給藥）。（5）在品種規(guī)格（濃度）發(fā)生變化時，計算MVD沒有進(jìn)行調(diào)整。（6）建立方法時所用的最大給藥劑量已經(jīng)超出了臨床所用劑量等。
3、在進(jìn)行干擾試驗預(yù)試驗時不干擾濃度的確定方法不正確
對預(yù)試驗的目的不理解，直接選用一個靈敏度的鱟試劑對應(yīng)的MVD或MVC進(jìn)行試驗，如無干擾則以該濃度為不干擾濃度，有的甚至直接選用高靈敏度的鱟試劑對應(yīng)的濃度作為不干擾濃度，未找到真正的不干擾濃度，使干擾試驗失去意義。也有的申報單位僅選擇1～2個樣品濃度進(jìn)行試驗，同樣使試驗缺乏完整性。
4、供試品陽性溶液配制濃度（方法）不對
在使用簡便方法配制供試品陽性溶液時，應(yīng)將供試品溶液與細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液等量混合、稀釋。如：配制含4倍稀釋供試品溶液的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，應(yīng)使用2倍稀釋供試品溶液和4λ細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液等量混合、稀釋。常見有的配制過程中直接使用4倍稀釋供試品溶液或2λ細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度等量混合，造成配制的供試品陽性溶液中細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品或供試品濃度低一倍。
5、僅使用一個廠家的鱟試劑或一個批號的樣品進(jìn)行干擾試驗，沒有足夠的代表性
2005年版藥典明確規(guī)定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查進(jìn)行干擾試驗時，應(yīng)同時使用兩個以上廠家生產(chǎn)的鱟試劑對至少三個批號的樣品進(jìn)行試驗，但有的申報單位僅用一個廠家的鱟試劑或僅對一個批號的樣品進(jìn)行試驗。因為大部分注冊藥品其生產(chǎn)工藝、所使用的敷料等均不是很穩(wěn)定，不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑其抗干擾能力也不盡相同，因此僅用一個廠家的鱟試劑或僅對一個批號的樣品進(jìn)行干擾試驗，沒有足夠的代表性，確定的不干擾濃度可能在后續(xù)的試驗中不準(zhǔn)確。
6、錯誤認(rèn)為一定要按最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）或最小有效濃度（MVC）進(jìn)行試驗
實際上，有的樣品濃度很高也不干擾鱟試劑與內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)，這種情況下，只要樣品內(nèi)毒素含量合格，可以在MVD范圍之內(nèi)，即小于MVD的倍數(shù)下進(jìn)行試驗。又如對樣品進(jìn)行檢查時，也可以先用原液（預(yù)試驗時原液無干擾）進(jìn)行試驗，如果內(nèi)毒素檢查也能合格，則不必進(jìn)行稀釋，這樣做的直接好處是可以節(jié)約成本和時間，減少污染環(huán)節(jié)。如果一個樣品在小于MVD的情況下試驗時樣品陽性管有干擾，或樣品管為陽性，則可按MVD進(jìn)行相對應(yīng)的稀釋后重新試驗。如：某注射液，說明書中臨床靜脈給藥最大劑量為7mg/h，制劑規(guī)格為10mg/ml，計算內(nèi)毒素限值為420EU/ml，所采用鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，計算MVD＝1680倍。顯然內(nèi)毒素限值確定不正確（人體對細(xì)菌內(nèi)毒素的最大耐受量為300EU/h ），已超過了人體對細(xì)菌內(nèi)毒素的最大耐受量；另外選擇最大有效稀釋倍數(shù)的稀釋液進(jìn)行試驗，每次實驗時要對樣品進(jìn)行1680倍的稀釋，會使實驗變得繁瑣，不利于操作。
7、應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行中國藥典2005年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的有關(guān)規(guī)定
藥典規(guī)定：（1）當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項品種建立內(nèi)毒素檢查法時，需進(jìn)行干擾試驗；（2）當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，需重新進(jìn)行干擾試驗。這就要求在提供的申報資料中應(yīng)提供相關(guān)的方法學(xué)驗證資料，以證明方法的可行性及有無干擾的存在。只有嚴(yán)格按照有關(guān)要求進(jìn)行了干擾試驗，并證明該條件下無干擾，才能建立新的檢查方法。有些錯誤的認(rèn)為國內(nèi)或國外已有生產(chǎn)的品種，方法學(xué)驗證就可以不做，以至有些新藥、仿制藥未進(jìn)行系統(tǒng)的干擾試驗
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