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結(jié)核桿菌可以導(dǎo)致全身性疾病，特別是在發(fā)展中國(guó)家，其發(fā)病率較高，危害性極大.近幾年結(jié)核桿菌的變異性較大，對(duì)抗癆藥物的耐藥性增加，從而使結(jié)核病的發(fā)病大幅度增高.雖然傳統(tǒng)的涂片抗酸染色、細(xì)菌培養(yǎng)以及胸片檢查對(duì)大部分結(jié)核能作出正確的診斷，但對(duì)某些病人亦可造成誤診或漏診;動(dòng)物接種雖特異性較高，但因時(shí)間較長(zhǎng)，不能滿足臨床快速診斷的需要.近幾年也出現(xiàn)了幾種快速診斷方法，但也存在較大的缺陷，如短期培養(yǎng)后抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)BACTEC培養(yǎng)瓶中被培養(yǎng)標(biāo)本所分泌的抗原，該方法可在BACTEC瓶本身鑒定出細(xì)菌之前，結(jié)合ELISA和涂片抗酸染色有效地鑒別典型和非典型分枝桿菌，敏感性較高，但存在培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，重復(fù)性尚差的缺點(diǎn).另一種是短期培養(yǎng)后核酸探針雜交法，即用特異性DNA探針與BACTEC瓶中培養(yǎng)的細(xì)菌染色體DNA雜交.該方法能有效地防止培養(yǎng)的假陰性結(jié)果，但卻易發(fā)生假陽(yáng)性結(jié)果，加之采用的方法較為復(fù)雜和繁瑣，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近來(lái)已較少應(yīng)用.上面兩種方法都要借助細(xì)菌培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行，雖然在時(shí)間上比傳統(tǒng)培養(yǎng)大大縮短，但缺乏快速診斷的優(yōu)勢(shì).近幾年興起的PCR方法基本實(shí)現(xiàn)了快速、靈敏、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核的目的，并且該方法正趨于常規(guī)化地應(yīng)用于臨床一般實(shí)驗(yàn)室.應(yīng)用PCR方法檢測(cè)結(jié)核桿菌的首要條件是設(shè)計(jì)一對(duì)特異性DNA引物.該引物所引導(dǎo)的DNA擴(kuò)增序列應(yīng)是結(jié)核桿菌獨(dú)有的，且是結(jié)核桿菌的保守序列，這樣才能保證檢測(cè)結(jié)果的特異性.PCR方法的另外幾個(gè)關(guān)鍵因素是:①DNA提取，即對(duì)有限的結(jié)核桿菌應(yīng)盡量地將其DNA完整、全部地提取;②TaqDNA聚合酶的活性;③PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法，即將PCR產(chǎn)物進(jìn)行快速、靈敏、安全、準(zhǔn)確的檢測(cè). 一、結(jié)核桿菌DNA的提取 在該技術(shù)上，目前仍無(wú)一種統(tǒng)一常規(guī)化的方法.現(xiàn)有各方法都存在著提取DNA不足的缺點(diǎn)，因此，敏感性受到影響.現(xiàn)在主要的細(xì)菌裂解方法是:①蛋白酶K加表面活性劑法;②蛋白變性劑加表面活性劑煮沸法;③反復(fù)凍融法;④超聲波法;⑤溶菌酶加表面活性劑法.提取DNA的方法主要有:①酚一氯仿提取法:即用酚一氯仿抽提含有裂解菌體的溶液，然后用乙醇從抽提后的溶液中沉淀DNA.有的學(xué)者將硅酮加入酚一氯仿中，使水相和有機(jī)相的界面更牢固，這樣不但能減少抑制因子混入水相，而且使DNA提取量比未加硅酮方法高20%～30%;②Chaotrop-silica法:用二氧化硅(sio2)吸附裂解菌體釋放出的DNA，該二氧化硅用70%乙醇洗滌，而后干燥，最后用雙蒸水洗脫(55℃).有報(bào)道認(rèn)為該方法可以消除痰中的某些抑制因子.有的學(xué)者發(fā)現(xiàn)未預(yù)裂解的結(jié)核桿菌直接煮沸進(jìn)行PCR的效果與預(yù)先處理的相仿，提示結(jié)核桿菌不預(yù)裂解也可直接進(jìn)PCR.但加入的菌數(shù)應(yīng)<約1000個(gè)，否則細(xì)菌蛋白會(huì)對(duì)PCR產(chǎn)生抑制作用. 二、引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)不同型結(jié)核桿菌的序列，目前常在下列幾種序列內(nèi)進(jìn)行引物設(shè)計(jì). (一)編碼結(jié)核桿菌抗原的基因序列 1.編碼65-KDa蛋白抗原的基因序列:結(jié)核桿菌65-KDa蛋白抗原為存在于所有分枝桿菌細(xì)胞壁中的熱休克蛋白，也是一種交叉反應(yīng)蛋白.所以依據(jù)該序列設(shè)計(jì)合成的引物，PCR能擴(kuò)增出所有分枝桿菌的靶DNA片段，沒(méi)有屬內(nèi)特異性.這種PCR較適用于結(jié)核病高發(fā)區(qū)大規(guī)模篩選和流行病普查.另外，對(duì)65-KDa蛋白基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切分析(RFLP)，也可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出結(jié)核桿菌的屬內(nèi)歸屬. 2.編碼MPB64蛋白的基因序列：MPB64蛋白為結(jié)核桿菌復(fù)合群(MTBC，包括人型結(jié)核桿菌、牛型結(jié)核桿菌、BCG、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)所特有.根據(jù)該蛋白的基因序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，對(duì)MTBC模板DNA顯示出高的特異性. 3.編碼38-KDa蛋白抗原b(Pab)的DNA序列:該序列僅存在于人型和牛型結(jié)核桿菌.采用在此基因內(nèi)設(shè)計(jì)合成的引物和探針進(jìn)行PCR，只能擴(kuò)增人型和牛型結(jié)桿菌的DNA序列，能檢出少至10個(gè)結(jié)核桿菌的純化DNA. 4.編碼32-KDa蛋白的基因序列:32-KDa是蛋白分枝桿菌的一種分泌蛋白，由它的基因序列設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行PCR，可以特異地檢測(cè)出分枝桿菌的DNA片段，能檢測(cè)出50fg的純化DNA，相當(dāng)于10個(gè)結(jié)核桿菌. 5.編碼MPB70抗原的基因序列:MPB70為牛型結(jié)核桿菌所特有，由該基因序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，對(duì)牛型結(jié)核桿菌的檢測(cè)具有高度的特異性和敏感性. (二)結(jié)核桿菌基因組重復(fù)序列 1.克隆DNA序列:目前所應(yīng)用的DNA序列都是MTBC所特有，拷貝數(shù)在10個(gè)以上，包括亞克隆重組質(zhì)粒pPH7301和克隆質(zhì)粒PMTb4，分別含KpnI-SmaI插入片段和EcoRI-BamHI插入片段.根據(jù)這些基因序列設(shè)計(jì)的引物，其檢出限在20個(gè)結(jié)核桿菌以下. 2.插入序列:結(jié)核桿菌的插入序列主要有IS6110和IS986，它們僅見(jiàn)于MTBC.這兩種插入序列在基因組中的拷貝數(shù)為1--20個(gè)，選擇插入序列作為擴(kuò)增的靶序列，可以得到較高的敏感性和特異性.尤其是IS6110，是目前進(jìn)行臨床PCR檢測(cè)的首選區(qū)段. (三)人型結(jié)核桿菌特異序列 mtp40是人型結(jié)核桿菌特異性DNA片段，Portillo等選擇mtp40作為靶序列，用PCR檢測(cè)結(jié)核桿菌，結(jié)果只能擴(kuò)增人型結(jié)核桿菌DNA，敏感性達(dá)到10fg純化DNA量. (四)分枝桿菌dnaJ基因 該基因?yàn)榉种U菌共有，但種間又存在差別，在該基因序列內(nèi)設(shè)計(jì)合成的引物和探針用于PCR檢測(cè)，能檢出50fg的純化分枝桿菌DNA，相當(dāng)于10個(gè)結(jié)核桿菌.并可用于區(qū)分結(jié)核桿菌和非典型結(jié)核桿菌的鑒別診斷. (五)rRNA序列 用“通用”引物在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，將16SRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢出限達(dá)0.1fg化的結(jié)核桿菌rRNA.臨床標(biāo)本中少至10個(gè)結(jié)核桿菌亦可被檢出，該方法由于加了一步反轉(zhuǎn)錄過(guò)程相對(duì)增加了難度，臨床一般少用. 三、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法 通常PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法是經(jīng)瓊脂糖電泳后，用溴化乙錠染色，然后在紫外燈下觀察或進(jìn)一步采用標(biāo)記的DNA探針雜交.為了進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度，現(xiàn)多在引物和探針的標(biāo)記上進(jìn)行改進(jìn).由于放射性標(biāo)記物的危害性，現(xiàn)多采用非放射性標(biāo)記，如生物素、熒光素、酶及化學(xué)發(fā)光劑.Wilson等在巢式PCR的內(nèi)側(cè)引物上分別摻入生物素和地高辛配基，這樣PCR產(chǎn)物兩端就分別帶有生物素和地高辛配基.PCR產(chǎn)物上的生物素和附著在微型滴定板表面的生物素蛋白結(jié)合，使PCR產(chǎn)物附著在滴定板上，另一端的地高辛配基和加入的抗地高辛配基堿性磷酸脂酶結(jié)合形成抗地高辛配基堿性磷酸脂酶偶合物，利用該偶合物405nm的吸收峰做光密度(OD)測(cè)定.另外，還可用吖啶酯標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用硼酸鈉將未雜交的探針?lè)纸猓缓蠹尤際2O2溶液和NaOH溶液使吖啶酯水解，最后測(cè)量吖啶的光通量.雖然這些方法安全、快速、但其敏感性還需進(jìn)一步提高，操作還需進(jìn)一步簡(jiǎn)化. 四、PCR檢測(cè)結(jié)核桿菌的敏感性和特異性 (一)PCR的特異性 PCR特異性的關(guān)鍵首先取決于所選靶序列的特異性.現(xiàn)在常用的靶序列有:①分枝桿菌共有的靶序列，如65-KDa蛋白基因序列;②MTBC特有的靶序列，如MpB64蛋白基因序列、IS6110序列.③人型結(jié)核桿菌特異的靶序列，如mpt40序列.引物設(shè)計(jì)對(duì)PCR的特異性也至關(guān)重要.引物序列在靶DNA上的專一性、以及引物的特異性和保守性，以及引物本身的許多特性，如G+C含量引物3'未端序列的特異性和保守性及引物長(zhǎng)度等都影響PCR的特異性，另外在設(shè)計(jì)引物時(shí)也要防止出現(xiàn)引物間的過(guò)多配對(duì)，以免形成過(guò)多的引物聚合體，造成非特異性擴(kuò)增. PCR擴(kuò)增TB的特異性除上述先決條件外，也與PCR反應(yīng)本身有極重要的關(guān)系.其中退火溫度是一個(gè)重要因素，退火溫度過(guò)低時(shí)，引物易發(fā)生非特異性結(jié)合，造成非特異性擴(kuò)增.由于結(jié)核桿DNA中G+C含量高，因此可以適當(dāng)提高退火溫度，以獲得更高的特異性. 另外，PCR緩沖液的組成，尤其是Mg2+濃度對(duì)PCR的特異性也有較大影響，Mg2+濃度過(guò)高，會(huì)提高PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，但同時(shí)也會(huì)增加非特異性擴(kuò)增. (二)PCR的敏感性 PCR的敏感性很高，一般可以檢測(cè)出1～100fg純化的結(jié)核桿菌DNA，相當(dāng)于1～20個(gè)結(jié)核桿菌，這種敏感性明顯高于涂片法和培養(yǎng)法.PCR還可以檢出培養(yǎng)法易發(fā)生失敗的病例，從而大大提高菌陰結(jié)核病的診斷.另外PCR檢測(cè)TBDNA不受抗癆治療的影響，可以準(zhǔn)確觀察抗癆治療的效果，防止血清學(xué)方法所帶來(lái)的假陰性結(jié)果.PCR敏感性受下列因素影響:①擴(kuò)增靶序列的拷貝數(shù).一般認(rèn)為，結(jié)核桿菌染色體中含靶序列拷貝數(shù)越多，PCR敏感性越高，如38-KDa蛋白的基因序列在結(jié)核桿菌染色體中只有一個(gè)，而IS6110序列的拷貝數(shù)卻有10～12個(gè)，結(jié)果PCR敏感性后者比前者高100倍;②PCR的循環(huán)次數(shù).在一定程度上，PCR循環(huán)次數(shù)越多，其敏感性就越高，但要合適.因?yàn)椋h(huán)次數(shù)過(guò)多會(huì)增加非特異性問(wèn)題，造成結(jié)果判斷上的失誤，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果;③結(jié)核桿菌DNA的提取技術(shù).處理標(biāo)本時(shí)首先要富集(如離心)標(biāo)本中的TB，使單位體積內(nèi)TB含量變高，從而增加了起始模板數(shù)，有利于提高PCR的靈敏性.同時(shí)提取過(guò)程要盡可能減少抑制成份，并提高DNA的提取率.④PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法.雖然DNA探針雜交要比直接電泳法敏感性高得多，但步驟繁瑣，這也是影響PCR臨床應(yīng)用的原因之一.但一般情況下，直接電泳法的敏感性完全能夠達(dá)到檢測(cè)的需要. 五.PCR在結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用 PCR檢測(cè)結(jié)核桿菌的優(yōu)點(diǎn)決定了它在臨床上的應(yīng)用價(jià)值和范圍，PCR檢測(cè)TB的優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)如下: 1.能早期診斷TB菌血癥:在TB感染的早期，特別是在TB病灶通過(guò)血源性外傳播時(shí)、及在外周血中存在極少量的TB時(shí)，PCR就能給于擴(kuò)增并確診.此外，由于外周血中TB的含量甚微，又沒(méi)有新的病灶形成，因而血清學(xué)方法和物理方法均難以達(dá)到確診的目的，而對(duì)這類(lèi)病灶的早期診斷在臨床治療上具有指導(dǎo)意義，因?yàn)樵缙诰Y是較易控制的，并可以防止繼發(fā)性TB病灶的形成. 2.時(shí)間短;PCR檢測(cè)TB僅需2-4h對(duì)于某些培養(yǎng)法難以實(shí)施的病例，PCR法則行之有效，同時(shí)提高了敏感性和特異性，可以檢測(cè)到1個(gè)TB菌. 3.有利于鑒別診斷:對(duì)于肺結(jié)核來(lái)說(shuō)，其中的結(jié)核球和成人型原發(fā)性結(jié)核等，經(jīng)常易于同肺癌的診斷相混淆.病灶中心部位經(jīng)常出現(xiàn)既未見(jiàn)TB又未見(jiàn)癌細(xì)胞的壞死區(qū).此時(shí)涂片檢測(cè)常是陰性的.在這種情況下，PCR檢測(cè)就顯得特別有效.它不但可以擴(kuò)增能著色的活菌，還可以擴(kuò)增已死亡的，但DNA尚未降解的死菌，從而確定這樣的病灶是惡性還是良性.在許多情況下，TB可以導(dǎo)致腦膜炎、胸膜炎、腹膜炎等.涂片法盡管在診斷上具有直接、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但敏感性差就局限了它的診斷范圍和實(shí)用價(jià)值.PCR檢測(cè)這類(lèi)標(biāo)本，可以說(shuō)極其有效.其極高的特異性和敏感性可以很容易地確定TB性腦膜炎及TB性胸腹水.另外，對(duì)于腎結(jié)核、泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核的診斷，PCR都可以予以完成. 4.抗癆治療的評(píng)價(jià):對(duì)于抗癆治療效果的評(píng)價(jià)，以前的方法顯得軟弱無(wú)力.而PCR法則可以通過(guò)定期檢測(cè)，采用定量PCR法確切地評(píng)價(jià)抗癆藥物的療效及殘存菌的數(shù)量和活性度.在體內(nèi)一般情況下，細(xì)菌死后，其蛋白系統(tǒng)很快崩潰，而DNA則能相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間地保存下來(lái).這些DNA在某種情況下又會(huì)復(fù)活.所以，細(xì)胞的死亡最可靠的評(píng)價(jià)指標(biāo)是其基因DNA的完全降解.特別是在許多問(wèn)題未搞清楚以前，更應(yīng)該以DNA的降解來(lái)判定病原體的死與活.從理論上講，PCR擴(kuò)增結(jié)果將是最可靠的療效評(píng)價(jià)指標(biāo). 5.修正以往所謂“正確”的觀念:致病菌與機(jī)體的防御系統(tǒng)是一對(duì)激烈的矛盾，致病菌可以以任何方式和通路打擊人體的防御系統(tǒng)，以便其生存和繁殖.在健康人群和周?chē)h(huán)境中都攜帶或存在有大量的TB，但何時(shí)何地才會(huì)造成機(jī)體致病呢?以往認(rèn)為T(mén)B很少存在于外周血，這主要是因?yàn)橥庵苎胁椴坏絋B，或TB已被局限在肺組織中.但很難讓人相信的是，肺部血管極其豐富，淋巴組織和血管網(wǎng)共同構(gòu)成人體的細(xì)胞外液貯存和交換的場(chǎng)所.所以，二者之間的交換是經(jīng)常的.這種交換就包括能透過(guò)毛細(xì)血管壁的致病菌.當(dāng)然，對(duì)于TB來(lái)講，大多數(shù)細(xì)菌將被機(jī)體的免疫器官禁固起來(lái).但仍有不少“漏網(wǎng)之魚(yú)”，只是以前所用的方法敏感性及特異性均不夠.但在某些情況下，如情緒低落、過(guò)度勞累、感冒等情況下，機(jī)體防御系統(tǒng)功能減弱，就會(huì)造成致病菌的攻擊發(fā)生疾病.所以PCR技術(shù)對(duì)于評(píng)估臨床療效、疫情的檢控、發(fā)病機(jī)理的探討均有十分重要的意義. 六、PCR在檢測(cè)TB中的注意事項(xiàng) PCR如操作不嚴(yán)格會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果. 發(fā)生假陽(yáng)性最常見(jiàn)的原因是:樣品間的污染和擴(kuò)增產(chǎn)物的污染.樣品間的交叉污染最易發(fā)生在樣品的處理過(guò)程之中.如大家共用一個(gè)加樣器、剪刀、位置等，因此在處理活檢標(biāo)本時(shí)，用剪刀剪碎組織塊，每個(gè)標(biāo)本用后，剪刀應(yīng)在火上燒數(shù)分鐘，以徹底清除污染在剪刀上的DNA.對(duì)于液態(tài)標(biāo)本的處理，盡可能在同一管子內(nèi)處理.用具應(yīng)為一次性的.要解決好擴(kuò)增物的污染，最佳的方式是減少操作的時(shí)間，簡(jiǎn)化操作手續(xù)并使用一次性離心管及接頭.因?yàn)閿U(kuò)增產(chǎn)物的量一般很高，易于污染實(shí)驗(yàn)室任何地方.所以減少打開(kāi)反應(yīng)管的次數(shù)會(huì)降低假陽(yáng)性的發(fā)生率. |
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