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無血清造血細胞培養(yǎng)基http://www.fszhuming.com/a/gb2312/info/2013/0413/5029.html

腫瘤細胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細胞是比較容易培養(yǎng)的細胞。當前建立的細胞系中癌細胞系是最多的。另外腫瘤對人類是威脅最大的疾病。腫瘤細胞培養(yǎng)是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學極其重要的手段。腫瘤細胞培養(yǎng)對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。
一、組織培養(yǎng)腫瘤細胞生物學特性
腫瘤細胞與體內(nèi)正常細胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內(nèi)的腫瘤細胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，其差異較小，但也并非完全相同。培養(yǎng)中的腫瘤細胞具以下突出特點：
（－）形態(tài)和性狀
培養(yǎng)中癌細胞無光學顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細胞鏡下觀察比二倍體細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細胞表面的微絨毛多而細密，微絲走行不如正常細胞規(guī)則，可能與腫瘤細胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關(guān)。
（二）生長增殖
腫瘤細胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細胞增殖生長的因子，而癌細胞在低血清中（2％～5％）仍能生長。已證明腫瘤細胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長的現(xiàn)象，已成為檢測細胞惡變的一個指標。癌細胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個細胞培養(yǎng)時，形成集落（克隆）的能力比正常細胞強。另外癌細胞增殖數(shù)量增多擴展時，接觸抑制消除，細胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。
（三）永生性
永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）。體外培養(yǎng)中的腫瘤細胞系或細胞株都表現(xiàn)有這種性狀，體內(nèi)腫瘤細胞是否如此尚無直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡，從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細胞的永生性是否能反證它在體內(nèi)時同樣如此？也尚難肯定。從近年建立細胞系或株的過程說明，如果永生性是體內(nèi)腫瘤細胞所固有的，腫瘤細胞應(yīng)易于培養(yǎng)。事實上，多數(shù)腫瘤細胞初代培養(yǎng)時并不那么容易。生長增殖并不旺盛；經(jīng)過純化成單一化瘤細胞后，也大多增殖若干代后，便出現(xiàn)類似二倍體細胞培養(yǎng)中的停滯期。過此階段后才獲得永生性，順利傳代生長下去。從而說明體外腫瘤細胞的永生性有可能是體外培養(yǎng)后獲得的。從一些具有永生性而無惡性性的細胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等細胞證明，永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀，受不同基因調(diào)控，但卻有相關(guān)性。可能永生性是細胞惡變的階段。至少在體外是如此。
（四）浸潤性
浸潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為，培養(yǎng)癌細胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時，能浸潤入其它組織細胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。
（五）異質(zhì)性
所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區(qū)的細胞獲得血液供應(yīng)多，增殖旺盛，中心區(qū)有的細胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細胞稱干細胞（Stem Cells）、只有這些干細胞才是支持腫瘤生長的成分。腫瘤干細胞培養(yǎng)時易于生長增殖；把干細胞分離出來的培養(yǎng)方法稱干細胞培養(yǎng)。
（六）細胞遺傳
大多數(shù)腫瘤細胞有遺傳學改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細胞群常由多個細胞群組成，有干細胞系和數(shù)個亞系，并不斷進行著適應(yīng)性演變。
（七）其它
腫瘤細胞在體外不易生長的原因可能由于：①依賴性：腫瘤細胞雖有較強克隆生長力，但仍有一定的群體性或與其它細胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互依存，二是腫瘤細胞與基質(zhì)成纖維細胞的依賴。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細胞后也會同時消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影響癌細胞增殖生長的活性；②腫瘤細胞的自泌也會因分散培養(yǎng)而被稀釋，達不到腫瘤生長的需求，降低腫瘤細胞的生長增殖力；③并非所有腫瘤細胞都有強的生長活力和長的Life Span，只有干細胞才有強的增殖生長能力，但這些細胞數(shù)量很少；④離體培養(yǎng)腫瘤細胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件。
二、培養(yǎng)方法
腫瘤細胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細胞培養(yǎng)與正常組織細胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。（一）要點
1．取材：
人腫瘤細胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng)，可貯存于4℃中，但不宜栽過24小時。
2．培養(yǎng)基：
腫瘤細胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細胞嚴格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細胞培養(yǎng)。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低，正常細胞培養(yǎng)不加血清不能生長，腫瘤細胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。腫瘤細胞對培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大，是因腫瘤細胞有自泌（Autocrine）性產(chǎn)生促生長物質(zhì)之故。但這并不說明腫瘤細胞完全不需要這些成分。按不同細胞需要不同的生長因子；腫瘤細胞與正常細胞之間、腫瘤細胞與腫瘤細胞之間對生長因子的需求都存在著差異。但大多數(shù)腫瘤細胞培養(yǎng)中仍需要生長因子。有的還需特異性生長因子〔如乳腺癌細胞等）。總之培養(yǎng)腫瘤細胞仍需加血清和相關(guān)生長因子培養(yǎng)更易成功。
3．成纖維細胞的排除：
成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。排除成纖維細胞有多種方法（表2－1）。

表2－1 抑制成纖維細胞生長因素

方法	因素	組織細胞
選擇性附著選擇性附著底物匯合飼細胞層選擇性培養(yǎng)基	胰蛋白酶膠原酶聚丙烯酰胺聚四氟乙烯（Teflon）膠原（豬皮）小鼠3T3 人胎小腸 D-纈氨酸（Valine） MCDB-710 MCDB-153 Phenobarbitone	胚胎小腸、心肌、表皮乳癌各種腫瘤轉(zhuǎn)化細胞表皮細胞表皮正常和惡性乳腺上皮結(jié)腸癌腎組織乳腺表皮肝細胞

注：上表結(jié)果為個別實驗室經(jīng)驗，僅供參考

（二）成纖維細胞排除法
1．機械刮除法：
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序為：
（1）標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；
（2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間；
（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；
（4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止
2．反復貼壁法：
根據(jù)腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類細胞相互分離，操作方法與傳代相同。
（1）待細胞生長達一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液；
（2）取編號為此A、B、C三個培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
（4）培養(yǎng)B瓶中細胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補加完全培養(yǎng)基。
當三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次，直至癌細胞純化為止。
3．消化排除法：
此法曾用于乳癌細胞的培養(yǎng)，具體程序是：
（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細胞脫落下來后，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內(nèi)也補加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經(jīng)過幾次反復處理，可能把成纖維細胞除凈。
4．膠原酶消化法：
本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。
（1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當發(fā)現(xiàn)成纖維細胞被除掉后，即終止消化；
（2）用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈，可再次重復。
5．其它方法：
有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.025～1.085的密度梯度離心液，加入細胞懸液后，在23℃中800g離心 10分種。在比重1.025～1.050層為成纖維細胞，在比重1.050～1.085層為上皮細胞，再經(jīng)過分離進行培養(yǎng)。最近也有人應(yīng)用特殊化學物如SOD抑制成纖維細胞生長的方法。
選用上述任何一種方法，都需進行試驗，取得必要經(jīng)驗，找出適合的條件，才能獲得好的效果。
（三）提高腫瘤細胞培養(yǎng)存活率和生長率措施
根據(jù)人們的經(jīng)驗，腫瘤細胞在體外不易培養(yǎng)，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。當腫瘤組織或細胞初代接種培養(yǎng)后，常出現(xiàn)以下幾種情況：
完全無細胞游出或移動；
有細胞移動和游出，但無細胞增殖，細胞長時間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代；
有細胞增殖，傳若干代后停止生長或衰退死亡；
傳數(shù)代后細胞增殖緩慢，經(jīng)過一段停滯期后，才又呈旺盛生長狀態(tài)，形成穩(wěn)定生長的腫瘤傳代細胞系。
以上現(xiàn)象說明腫瘤細胞對體外生存條件有較高的要求，并需經(jīng)過對新環(huán)境的適應(yīng)才能生長，因此欲獲得好的培養(yǎng)效果，不能局限于一般培養(yǎng)法，必須采用一些特殊的措施。
1．適宜底物：
把經(jīng)過純化的細胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細胞層等。
2．生長因子：
應(yīng)用促細胞生長因子，向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細胞生長因子。根據(jù)細胞種類不同選用不同的促生長物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。
為提高腫瘤細胞對體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)力和增加有活力癌細胞（干細胞）的數(shù)量，可采用動物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后，再從動物體內(nèi)取出進行培養(yǎng)，能提高體外培養(yǎng)的成功率。受體動物以裸鼠最好。
3.動物體媒介培養(yǎng)方法：
（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污，切成1～3毫米小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤塊；
（2）飼養(yǎng)觀察，待腫瘤生長達較大體積后，剝?nèi)〕隽鼋M織；
（3）進行體外培養(yǎng)。
（4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續(xù)在裸鼠體內(nèi)傳代。通過裸鼠媒介接種，有活力的腫瘤細胞數(shù)量增多，細胞培養(yǎng)易于成功。
腫瘤細胞培養(yǎng)方法與培養(yǎng)正常細胞完全相同，但成功率比正常細胞高。
（四）體外培養(yǎng)腫瘤細胞生物學檢測
一旦培養(yǎng)的腫瘤細胞生長成形態(tài)上單一的細胞群體或細胞系（或株）后，不論用于實驗研究還是建立細胞系，都需要做一系列的細胞生物學測定，主要的目的在于求得證明：
所培養(yǎng)的細胞系的確來源于原體內(nèi)具有惡性的細胞，而非正常細胞或其它細胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學性狀。測定項目數(shù)量無明確規(guī)定，根據(jù)需要而定，以下為常做的項目和要點。
【形態(tài)觀察】主要觀察細胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。
【細胞生長增殖】檢測細胞生長曲線、細胞分裂指數(shù)、倍增時間、細胞周期時間。
【細胞核型分析】檢測核型特點，染色體數(shù)量、標記染色體的有無、帶型等。
【凝集試驗】檢測凝集力。
【軟瓊脂培養(yǎng)】檢測集落形成能力。
【異體動物接種】向異體動物體內(nèi)（皮下）接種細胞懸液，觀察成瘤能力。
【其它】除上述項目外，根據(jù)需要還可做同位素標記、組織化學成分分析，熒光顯微鏡觀察等。
在上述腫瘤細胞生物學檢測中，最主要的為：異體動物（以用裸鼠為上）接種成瘤、軟瓊脂培養(yǎng)、核型分析、細胞骨架和電鏡觀察等幾項。當然從分子細胞學角度考慮尚應(yīng)做癌基因和抗癌基因等的檢測，這些項目將在本書第二篇中介紹。
（五）對腫瘤細胞系或細胞株的評價
已建成的各種腫瘤細胞系或細胞株，無疑都是可用的實驗對象。近年我國已建成的腫瘤細胞系已非常多，并獲得越來越廣泛的應(yīng)用。但根據(jù)研究者的經(jīng)驗，在使用這些細胞系時，應(yīng)持特別審慎態(tài)度，主要是應(yīng)考慮到這些細胞在長期傳代中有否發(fā)生遺傳性改變的可能。眾所周知，長期傳代細胞系染色體核型常是不穩(wěn)定的。另外也可能發(fā)生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結(jié)果可能導致細胞產(chǎn)生生物學性狀上的變動。以近年建成的各種腫瘤細胞系為例，都已傳代少則幾十，多則百代以上后，才確認建成了細胞系。這種情況下很難保證細胞從初代到建成時的性狀仍是一致的。已如前述，癌細胞在培養(yǎng)中并非能很順利地傳下去，凡已長期傳代的細胞系，都已獲得不死性。當前尚未完全確證所有癌細胞都具有不死性；因此尚難肯定在長期培養(yǎng)中的癌細胞的生物學性狀與體內(nèi)時仍完全相同（包括不死性）。據(jù)上述對用癌細胞系所獲實驗結(jié)果應(yīng)盡量做分析性的結(jié)論，避免做概括性的與體內(nèi)等同的結(jié)論，外推與體內(nèi)等同更是不妥的。廣泛來說，應(yīng)用各種較長時間培養(yǎng)細胞做實驗時，都應(yīng)如此。