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消化法原代培養(yǎng)兔胸主動脈平滑肌細胞 用DMEM配0.2%的1型膠原酶（用20的血清的DMEM配可能更好，有類似文獻），分裝于青霉素小并，每并2-3ml。1只免的胸主動脈置于1 瓶消化液中消化，消化約10幾個小時（消化程度的把握要體會），離心后，接種（若見細胞量大，成功把握大），絕對靜置3天（沒必要看，看多了無益），8天可傳代。 犬胸主動脈平滑肌貼塊法—— 方法成熟，比消化法好控制的多。 1、取材過程要快，取好放4度儲存的D-hanks液帶入超凈臺，不然先天不足； 2、塊大小密度影響不是很大（盡量小），關鍵是邊緣要盡量整齊，選用快刀快剪； 3、一定要貼牢，翻瓶時間個人不一，有3－5小時的，也有貼塊直接翻瓶的，關鍵還是貼牢，另外在貼牢的基礎上盡量早接觸培液，可以在剪塊的時候加少量培液略濕潤，鑷子夾塊到培養(yǎng)瓶后，用吸管之類的細長工具將塊均勻鋪好，加剛好覆蓋組織塊的培養(yǎng)液量（25cm2培養(yǎng)瓶大概2ml），半小時到一小時內就可翻瓶，動作要輕，從培養(yǎng)瓶一角試著翻，如果塊飄起，則再過會翻； 4、貼塊無內膜外膜面之分，亦無需刮除內膜，若內膜面向下，會有少量內皮細胞爬出組織塊，但只要平滑肌細胞一旦爬出來，內皮細胞生長自然不占優(yōu)勢，會因為平滑肌細胞大量爬出、增殖而漂起來，換液可洗掉，另外傳代可純化平滑肌細胞。 5、培液Gibco的 DMEM（高糖4500mg/L）加四季清新生牛血清20%。 建議用1次性培養(yǎng)瓶，成功機會大于玻璃瓶。成功后再小心過度成玻璃瓶。塊愈小愈好。用新刀，快，損傷小。全過程越短越好。組織塊的邊緣不齊整也不是什么很關鍵的問題，最重要的是組織塊要盡量小，盡量能剪成小米粒大小；另外就是組織塊要貼牢，其關鍵就是培養(yǎng)液可以在6小時后翻瓶的時間再加，這樣就可以避免組織塊貼不牢而懸浮起來的尷尬了。 人臍靜脈內皮細胞的體外培養(yǎng)、鑒定及形態(tài)觀察 1.標本采集 在無菌條件下于健康產婦分娩后立即取新生兒臍帶， 擠出臍帶血管中的血液，放入裝有含青鏈霉素的PBS液瓶中，2h之內行臍靜脈內皮細胞培養(yǎng)。 雙抗：青霉素100u/ml; 鏈霉素100μl/ml PBS：KCl 0.2 g/L, KH2PO4 0.24 g/L, NaCl 8.0g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L或Na2HPO4 1.44 g/L。 在800ml蒸餾水中加入上述質量物質，用鹽酸調節(jié)溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高壓蒸汽滅菌20分鐘，室溫保存。 2.原代血管內皮細胞的獲取與培養(yǎng) 按Jaffe等人〔1〕的方法加以改進。在無菌條件下取新生兒臍帶，剪去鉗痕和凝血塊阻塞部分，找到臍靜脈。一端插上帶有膠管的玻璃管結扎固定，經膠管接注射器，用生理鹽水灌洗。待臍靜脈內的殘血除凈后，用37℃ PBS，沖洗兩次，將另一端用鐵夾夾閉，向臍靜脈內灌注0.25%胰蛋白酶8～10ml，夾閉膠管放入已滅菌的大平皿中。37℃孵育12min，在此期間經常翻動臍帶使酶溶液在血管內流動以促使內皮細胞均勻與酶接觸。取出臍帶后輕輕擠壓管壁，將含有內皮細胞的胰蛋白酶注入50ml錐形離心管中，加入小牛血清2ml終止酶反應。再以30ml PBS沖洗管腔，流出液一并入離心管，1000r/min離心10min，棄上清，加入含有10%小牛血清的DMEM [或IMDM(Dibco)？]培養(yǎng)液，充分混合制成細胞懸液。取0.1ml細胞懸液在血細胞計數(shù)板計數(shù)。最后調細胞數(shù)，以1×105/ml 接種至24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml。置于5%CO2，37℃靜止培養(yǎng)24h更換培養(yǎng)液，以除去未貼壁的細胞。以后每隔2d換液1 次，以維持細胞的營養(yǎng)和內環(huán)境的穩(wěn)定。 胰蛋白酶溶液（100ml）配制： 1）將D-Hanks（橙紅色）液高壓消毒滅菌，用NaHCO3液調節(jié)pH至7.2左右。 2）稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許消毒的鹽溶液調成糊狀，然后再補足鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4小時或冰箱內過夜，并不時攪拌振蕩。 3）次日先用濾紙粗慮，再過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱或－20℃保存?zhèn)溆茫Ｓ脻舛葹?.25%或0.125%；胰蛋白酶溶液（深紅色）偏酸，使用前用NaHCO3調pH至7.2左右。 D－Hanks液配制：KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06 g/L , NaCl 8.0g/L, NaHCO3 0.35 g/L, Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, 酚紅0.02 g/L 3．傳代內皮細胞的培養(yǎng) 原代內皮細胞融合后用培養(yǎng)液沖洗兩次，然后用0.25%胰酶加入到內皮細胞中，每孔0.3ml。邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察。細胞皺縮、彼此分離或呈大片狀分離即可終止消化。加入含有10%小牛血清的培養(yǎng)液，吸管吹打，制成細胞懸液，計數(shù)后按105個細胞/ml，繼續(xù)培養(yǎng)。 4．血管內皮細胞的鑒定 1）倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)特點。 2）VWF相關抗原免疫熒光檢查：在24孔塑料培養(yǎng)板孔內放置無菌的蓋玻片0.5cm×0.6cm，每孔中種植1ml含有 105個細胞的原代或傳代內皮細胞懸液。待內皮細胞生長至近融合狀態(tài)時，取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，投入冷丙酮中 (-18～-20℃)，細胞面向上，作用7min，用PBS沖洗3次，每次1min，而后進行間接免疫熒光檢查，第一抗體為鼠抗人VWF單克隆抗體(蘇州醫(yī)學院血栓室提供)，1∶20倍稀釋，加入50μl于蓋玻片上，放入濕盒內4℃過夜。同時不加一抗做陰性對照。用PBS沖洗3次后，加入異硫氫酸標記的二抗50μl(異硫氰酸標記羊抗鼠IgG，北京)，放入37℃2h后，用PBS洗滌3次。然后立即在熒光顯微鏡下觀察，攝片。 血管內皮細胞鑒定結果： VWF相關抗原間接免疫熒光檢查，原代及傳代培養(yǎng)的內皮細胞漿中有黃綠色的熒光著色，胞核呈黑綠色，整個細胞輪廓清楚。作為對照的內皮細胞片子中，偶見綠色斑點散發(fā)熒光，未見細胞輪廓。 5．內皮細胞體外生長情況 用胰蛋白酶消化的人臍靜脈內皮細胞，接種在24孔塑料培養(yǎng)板各孔內4h后，大部分細胞貼壁。早期細胞呈小多角、球形、呈團狀，少數(shù)細胞伸展，48～72h 生長最快，逐漸生長成梭形，有些細胞排列呈魚貫狀相連，間有旋禍狀排列。核清晰，呈圓形或橢圓形，核分裂相多見，1～2核仁，胞漿豐富，內含小顆粒。于 3～4d后融合，7～10d胞體呈多角形，相互嵌合，為單層呈鋪路石狀排列。 人臍帶靜脈內皮細胞的分離培養(yǎng)與增殖試驗（劉 金） 血管內皮細胞不僅參與調節(jié)血管通透性和凝血過程，在免疫調節(jié)，移植排斥，腫瘤轉移，炎癥等許多過程中也具有重要作用。內皮細胞培養(yǎng)是體外研究內皮細胞功能的重要手段。70年代Eric等建立了內皮細胞分離及體外培養(yǎng)的方法。人臍帶靜脈是人血管內皮細胞最易獲取的來源，在人內皮細胞的研究中被普遍采用。 ㈠ 原理 在體外，內皮細胞在內皮細胞生長因子存在的條件下可迅速增殖，并可傳代，可作為內皮細胞增殖，細胞因子分泌、表型等研究的模型。 ㈡ 方法 1. 臍帶內皮細胞的分離 試劑與器材 （1）膠原酶(Sigma)：I型 ((C-0130),用無血清RPMI 1640配成0.1%(W/V),分裝、-20℃保存。 0.1％明膠：稱取明膠，用三蒸水配成0.2％(W/V)溶液，37℃水浴溶解，過濾，放4℃?zhèn)溆谩?即用過濾法消毒) （2）Cord Buffor 肝星狀細胞培養(yǎng) 材料 相差顯微鏡，熒光顯微鏡，手術器械，雄性SD大鼠，體重250-450 g，戊巴比妥鈉，200目尼龍網，小牛血清（或胎牛血清，則更好），DMEM，胰酶消化液（以HBSS配），Nycodenz（以GBSS配），D- Hanks'（KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4.7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚紅 0.02 g/L），HBSS，臺盼蘭等。 方法 大鼠腹腔麻醉--<剖腹 --<門靜脈插管-- 傳代方法：棄培液--<以D- Hanks'液洗兩次--<0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化--<鏡下觀察細胞突起回縮（2-5分鐘左右）--<以完全培液（DMEM+10% NBS）終止反應（若不用EDTA，可以不需離心）--<吹打，1:2-1:3接種，然后繼續(xù)培養(yǎng)（5% CO2，37度）。 結果 次日，光鏡下可見細胞呈星芒狀，胞質內有脂滴，熒光鏡下328 nm處見自發(fā)熒光。 討論 進一步鑒別需要做免疫組化：Desmin和alpha-SMA；后者在細胞激活后才表達。也采用過無須原位消化的方案，完全可行，只不過消化時間更難控制！ 參考文獻 袁桃霞，張錦生，張月娥，等. 大鼠肝Ito細胞的體外培養(yǎng)及肝素對其抑制作用的觀察. 上海醫(yī)科大學學報 1996;23(2):90-93。 乳鼠心肌細胞培養(yǎng)方法詳述 一．材料 所需液體：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、雙抗液、碳酸氫鈉液、鹽酸液。 試劑 Trypsin, SDS, DMEM 均購于 Sigma Chemical Co.小牛血清購于杭州四季青生物制品有限公司，其余均為國產分析純。 取鼠：標準SD大鼠，鼠盆用棉鋪好，取鼠。 物品：白大衣、飯盒 小剪子、小鑷子（4套）（一套剪皮膚、一套開胸取心，一套剔除心緣纖維組織，一套剪碎心臟） 瓶皿（2套）[兩個小圓培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿內加DMEM液，先后裝取出的心和剔出纖維組織后的心] [一個小燒杯裝碘酒和酒精棉球] 250ml燒杯3個[一個用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一個裝0.1％新潔爾滅150ml左右，消毒小鼠] 500ml燒杯1個，用作廢液缸。 50ml燒杯3個（剪碎心肌組織，最后配液） 三角燒杯（50ml）+小轉子（小轉子，酒精擦，雙蒸水沖后，再把酒精徹底沖掉后用三角燒杯高壓） 離心管及帽（12-14個），兩個試管 吸管 （5~8個）大鑷子 （兩把，持物，例夾棉球等） 臺面：磁力攪拌器、紗布（事先用于托盤裝0.1％新潔爾滅浸泡）、試管架、泡沫塑料板、五個針頭（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大鑷子兩把（一把夾棉球，一把取鼠）、3個250ml燒瓶（一個裝一蒸水，一個裝新潔爾滅，另一為空的備用）1個 500ml燒瓶（廢液缸）、溫度計、PH試紙（事先調PH值）、酒精燈、打火機/火柴、載玻片（5-10個）[用于培養(yǎng)前看接種密度及消化后看細胞密度]、注射器5ml 6個（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2個（雙抗液）20ml備用 2個、微量加樣器1000ml及500ml 以上物品均用紫外線照30分鐘。 另外準備手套、帽子、口罩、24孔培養(yǎng)板、離心機、未凍藥品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。 事先把顯微鏡、離心機、磁力攪拌器電源插好。檢查酒精燈是否有酒精，碘酒和酒精棉球是否夠用。先把物品遞入，后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精燈打開，把瓶皿擺好，再用一個瓶皿裝酒精棉球。 二．培養(yǎng)方法： 事先檢查顯微鏡、磁力攪拌器及離心機是否好用，提前三小時把小牛血清、胰酶、抗生素拿出來化開。其余未凍藥品也提前20分鐘拿出來緩和一下。新潔爾滅（0.1％）泡紗布（用10ml5％的新潔爾滅加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液），用酒精棉球擦拭臺面后把物品擺放好，開紫外線燈照30分鐘后開鼓風機吹至實驗結束。 具體方法為： 1. 把兩個5ml注射器分別插入DMEM和胰酶中，分別向兩個圓皿中加入5ml的DMEM培養(yǎng)液。用一把大鑷子從鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠，放入 0.1％新潔爾滅浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用針頭把鼠固定（位置擺正），用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘，取一把小剪子及小鑷子開皮，充分撕拉開，再用酒精棉球消毒，后換另一把小剪子和鑷子在劍突處正中線稍偏左開胸取心。
2. 取出的心放在剛才準備的一個裝有DMEM的圓皿中再取下一只。重復以上過程。（鼠全部殺死后，把取鼠鑷及泡沫板、新潔爾滅缸等拿出臺面。消毒、清潔，鋪紗布、換手套。 3．用第三副剪子和鑷子把圓皿中的心臟周邊的血凝及纖維組織剔除掉，放在另一個預先裝好DMEM的圓皿中。抽取5ml的胰酶，然后將其中少許放入50ml的小燒杯中，大部分倒入三角燒瓶中。用第四副剪子將燒杯中的心臟剪成1mm3的碎塊，倒入三角燒瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰酶刷凈燒杯。 4．把溫度計和三角燒杯放入250ml燒瓶中，（事先調好水量，多會沒過三角燒杯，少溫度會不均勻）。打開磁力攪拌器電源，調溫度（使-緩慢加到34~35℃）和轉速（轉速不可過快，否則會打碎細胞，基本上標志為平行）。一定要注意監(jiān)控。 5．溫度達到34℃時開始計時，第一次為10分鐘，以后可為8分鐘，事情況而定。在此期間，在試管架上擺上5、6個離心管，標上1、1，2、2。其中在1號兩管事先加入DMEM液各2毫升 6．10分鐘后，把三角燒瓶取下，磁力攪拌器關上，用一個吸管輕輕吹打（使消化下來的細胞徹底從組織團快上掉下來），這個吸管（1）用后固定放在一個離心管中，以后每次消化后取下都用其吹打幾下，第一次上清棄去，然后向兩個1號管分別倒入2ml上清（盡量不要把組織倒出，也不要剩液太多，以免消化下的細胞重復消化造成損傷），用另一個吸管（2）混勻配平兩個管（即兩個管水平高度相同），輕輕吹打，以免損壞細胞。 7．接著把這兩個離心管放入離心機中，調10分鐘，800或1000轉，打開關。 8．同時向三角燒瓶中加入5ml胰酶，繼續(xù)消化8分鐘，注意控制溫度。此時向兩個2號管中分別加入2mlDMEM液。 9．取下三角燒瓶，仍用1號吸管吹打，后靜置片刻向兩個2號管分別倒入2毫升的上清，取出兩個離心后的1號管，把上清液沿細胞貼壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入4ml的DMEM液，用2號吸管取少量液體加入另一個離心管中，把管底的沉淀細胞洗下來，把液體全部移入其中一管，三個管（1個1號管，兩個2號管）配平，放入離心管中，離心十分鐘。同時仍加5ml的胰酶，放入三角燒瓶中，繼續(xù)消化（注意控制溫度，達34℃時計時）。 10．消化到4次左右，吹打均勻后，吸一滴滴在載玻片上，拿到鏡下觀察消化情況，決定消化次數(shù)。 11．離心2次的吸管，放在試管架上，待離心過程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3ml（不用精確，大致這樣）DMEM液，記住共加入多少DMEM液的量，換吸管（3號）把各管底細胞塊吸下吹打均勻后，移入50ml燒杯中，然后用注射器抽取余量的DMEM加入燒杯中，加入小牛血清及抗生素，換吸管（4號）吹打均勻。 12．取出24孔培養(yǎng)板，一個人吹打，另一個人用加樣器加藥。封蓋時過火，蓋上蓋，放在CO2孵箱。24小時后觀察是否貼壁。 （24孔板，每孔最多加2ml，一般加液時每孔加1~1.5ml） 三．討論 乳鼠心肌細胞屬于原代生長細胞，培養(yǎng)過程較為繁瑣。文獻上有多種濃度胰酶消化方法，我們在試驗中摸索到0.06％濃度的胰酶對細胞損害較小，比起一些文獻記載的0.15％濃度有一定的優(yōu)越性，但這個濃度消化所需時間較長，所以我們又采取多次反復低濃度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，離心所得即為心肌細胞。利用心肌細胞和成纖維細胞貼壁時間的不同, 采用差速貼壁1 h, 除去成纖維細胞，達到純化的目的。成纖維細胞胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質突起，生長時呈放射狀。很好和心肌細胞鑒別[1]。 心肌細胞剛接種時形狀為圓形或橢圓形，大約在一天左右基本貼壁，此時細胞伸出偽足，偽足在鏡下為纖維狀條索，細胞胞體則呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，如多角形，部分細胞有聚集傾向，細胞搏動效果較好，DMEM培養(yǎng)基在初始培養(yǎng)時為深紅色，兩天后變?yōu)榈S色，應該是營養(yǎng)成分下降的表現(xiàn)，也說明細胞生長狀況良好。我們也參考了一些國外文獻的培養(yǎng)方法加以補充[2]。 四．參考文獻 1.Wang HX, Zhang WM, Sheng JZ, Wong TM. High carbachol increases the electrically induced [Ca2+]I transient in the single isolated ventricular myocyte of rats [J]. Eur J Pharmacol, 1997；319：91-9 2.Animal cell culture methods edited by Jennie P.Mather and David Barnes.--California:Academic Press,c1998.--xiv,368p.24cmSBN0124800408:CNY619.26 原代胚胎成纖維細胞培養(yǎng) 一、實驗器材：手術小直剪刀三把、眼科直鑷子三把、眼科彎鑷子兩把、玻璃平 皿三套、200目尼龍濾網、50ML、15ML離心管和手術刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。 二、實驗試劑：無Ca+2和Mg+2的 PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纖維細胞（MEF）生長培養(yǎng)基:高糖DMEM加10%FCS。 三、實驗動物：孕期14至16天的孕鼠 四、實驗步驟： 1. 處死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超凈臺中用一把剪刀和一把鑷子把孕鼠外皮剪開，用另外一把剪刀和一把鑷子把內皮剪開，露出子宮，最后用第三把剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。 2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內臟，將其余胚胎轉移到一個裝有30MLPBS的50ML離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉PBS，再重復此步驟一次，留少許PBS將胚胎轉移到另一裝有PBS的平皿中，用手術刀片將其細細切碎。 3.用200ul的移液槍反復快速吹打平皿中的液體，放在15ML離心管中，4℃1500rpm離心5分鐘，倒掉上清，加10ML胰酶，重懸沉淀，放37℃水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。 4.將上層細胞懸液倒入一裝有 10MLMEF生長培養(yǎng)基的50ML離心管中，用200目尼龍濾網過濾后，1500rpm離心5分鐘收集細胞。30ML MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次（此步驟中作者試過用無血清的培養(yǎng)基洗滌，結果無差別）。 5.細胞沉淀用15ML生長培養(yǎng)基懸起，細胞計數(shù)（八只14天胎鼠可獲得2-3×107細胞）。 6.3×106細胞懸浮于15ML MEF生長培養(yǎng)基中，接種到200ML的培養(yǎng)瓶中。 7.24小時后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。 8.細胞長滿后，先用PBS沖洗，倒掉，加胰酶消化（此步時間不宜過長，作者一般不超過五分鐘），按1：5傳代。 9.細胞再次長到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規(guī)凍存。（凍存液要現(xiàn)配） 五、討論 1.原代培養(yǎng)，一定要避免污染。 2. MEF生存能力有限，如果不凍存，體外存活十代左右。 3. 凍存后復蘇的細胞只能傳代一次，因為這些細胞繁殖能力有限。 4. 消化細胞時間不要過長。 大鼠皮層神經元原代培養(yǎng) 液體配制： 硼酸硼砂緩沖液：0.05M四硼化鈉45ml，0.2M硼酸55ml，pH8.4； 胰酶－EDTA消化液：胰酶－0.125g；EDTA－0.2g；D-Hanks平衡鹽液定容至100ml 所用的培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶或玻片預先經100μg/L多聚賴氨酸硼酸鹽緩沖液于37℃包被4h，三蒸水洗三遍晾干備用。 操作步驟如下： 1. 孕16d SD大鼠經戊巴比妥鈉麻醉后，碘酒、75％乙醇消毒腹部皮膚，依次剪開皮膚、肌肉、皮下筋膜，無菌操作下取出胚胎放入預冷的D-Hanks平衡鹽液中。 2.在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜，剪碎組織成約1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱內消化20min，中間搖晃一次。 3. 隨后用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的培養(yǎng)液（DMEM＋10％FBS）的離心管內終止消化液作用5min。 4. 用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的DMEM＋10％FBS的離心管內，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，靜置后取上清吸到另一支離心管內。重復上述步驟2～3次。 5. 將所收集的上清經200目篩網過濾。 6.過濾后的細胞懸液于800r/min離心5min，棄上清，管內加入新鮮培養(yǎng)液（DMEM＋20％FBS）并吹打成單細胞懸液。 7. 細胞計數(shù)，調整細胞密度按1.5×105/cm2種入6孔板內，放入CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后換液并加入Ara- C使其終濃度為1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量換液。以后每隔3天半量換液一次。 『注意以下幾點』 1.上面的步驟是傳統(tǒng)方法。有許多地方可以進行改動：如消化時可以直接用0.125－0.25的胰酶消化15－20min左右，也可用DNA酶進行消化，有人還直接進行吹打，都可行。 2.上面雖然時大鼠皮層神經元，但是同樣適用于小鼠，但是應該選擇 孕13d 左右的小鼠。 3.神經元是一種比較難培養(yǎng)的細胞，因此在接種時細胞的密度一定要夠！！ 4.在玻片上培養(yǎng)神經元時，一定要注意玻片的來源和處理方法，這個非常重要，對神經細胞的影響是很大的。如果您現(xiàn)在在玻片上培養(yǎng)的神經元生長情況還不錯的話，那么您在以后的培養(yǎng)中最好還是用同一來源（廠家）的玻片。 5.如果有B27和neurobasal培養(yǎng)基，那么就方便了（不用加AraC）－－ 1）把細胞懸液用（DMEM＋20％FBS）懸浮，種到培養(yǎng)皿上6－12h后，全量換成2％B27的neurobasal培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，3d半量換液。 2）把細胞懸液用直接用2％B27的neurobasal培養(yǎng)基懸浮接種。 3）可以用新生1d內的胎鼠皮層直接培養(yǎng)。 膠質細胞培養(yǎng)（astrocyte, oligodendrocyte） 取材及膠質細胞的混合培養(yǎng) 1.P2 SD大鼠經低溫麻醉后以碘酒和75％乙醇消毒，無菌操作下，斷頭放入預冷的D-Hanks液中，在解剖顯微鏡下取大腦皮層并除去腦膜。 2. 剪碎組織成1mm3大小，加入胰酶 -EDTA消化液并放入37℃孵箱內消化20min，中間搖晃一次。 3. 隨后用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的MEM＋10％FBS（Glial Medium，GM）的離心管內終止消化液作用5min。 4. 吸出組織轉移到另一支裝有冷的GM的離心管內，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，靜置后取上清并吸到另一支離心管內。重復上述步驟2～3次。 5.所得上清于800r/min離心 5min，棄上清，管內加入新鮮GM并吹打成單細胞懸液。細胞計數(shù)，調整細胞密度按1.5×105/cm2種入25cm2培養(yǎng)瓶，放入孵箱培養(yǎng)。以后每隔2～3d進行全量換液。 搖床振搖分離星形膠質細胞和寡突膠質細胞 培養(yǎng)至7～10天，換液后放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，取出擰緊培養(yǎng)瓶蓋，于37℃恒溫搖床上280r/min搖動18h。此時寡突膠質細胞90％以上在培養(yǎng)懸液內而與瓶底貼壁的星形膠質細胞分離。 分離培養(yǎng)懸液內的寡突膠質細胞 吸出懸液至離心管內950r/min離心 10min，棄上清后管內加入新鮮GM，吹打成單細胞懸液，按1.5×105/cm2種入預先用 100μg/L多聚賴氨酸包被好的35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)。24h后換成DF12＋N2的無血清培養(yǎng)液，此后每三天半量換液1次。 瓶底星形膠質細胞的繼續(xù)培養(yǎng) 25cm2培養(yǎng)瓶內的星形膠質細胞用D-Hanks液洗2次后常規(guī)傳代，以1.5×105/cm2種入預先用100μg/L 多聚賴氨酸包被好的35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)。培養(yǎng)液為GM，每三天半量換液1次。 動脈粥樣硬化患者VSMC的提取 實驗材料：眼科剪刀1把 眼科鑷子2把 1×PBS約200ml M199培養(yǎng)液 離心機 5ml小皿 10ml大皿 實驗步驟： 1.在超凈臺內用10ml的離心管分裝5ml的1×PBS（已高壓滅菌）。 2.手術臺上取患者發(fā)生動脈粥樣硬化改變的病變動脈，分放入準備好的PBS中，拿回實驗室在超凈臺中，無菌條件下剝去外膜，用手術刀片刮去內膜，留下中膜并將其剪成1×1mm大小組織塊。 3.消化法：PBS清洗組織塊后并將其轉移入10ml的離心管，加入0.125％胰酶消化37℃30分鐘，室溫吹打100分鐘或者振蕩器振蕩100分鐘，待組織塊變小且消化液變粘時，收集消化液配平以1500轉/分鐘離心10分鐘后，收集細胞種植于預先加入M199培養(yǎng)液的 5ml小皿中放入37度5％CO2的培養(yǎng)箱中。 4.貼塊法：PBS清洗組織塊后移入已準備好的10ml大皿中，塊間距為0.5cm，放入37度5％CO2的培養(yǎng)箱中，3小時后，待組織塊貼壁后，再加入2ml培養(yǎng)液后放回37度5％CO2的培養(yǎng)箱中。注意：最后加入2ml培養(yǎng)液時應使其順無組織塊的皿邊緣緩慢流下，勿使組織塊吹下。 5.隨后每3天予以半量換液。 6.一周后可見組織塊周圍有細胞爬出，大約3周后80%融合。因本人系非細胞生物學專業(yè)人員，本細胞培養(yǎng)時間又很短，多次進行細胞傳代未成功，還望有經驗的專家指點。 膀胱平滑肌細胞細胞原代培養(yǎng) 1.麻醉后消毒，下腹正中切口于膀胱頸（結扎處遠端約1~2cm） 2.嚴格無菌操作取出標本、手術臺位于超凈臺旁 3.在超凈臺，40u/ml慶大霉素溶液中浸泡5分鐘 4.生理鹽水漂洗1次 5.D－h(huán)anks液漂洗1次 6.放入D－h(huán)anks液中，除去粘膜、粘膜下及漿膜 如果是Shame組兔，以10ml注射器抽取約8ml D－h(huán)anks液，于粘膜層下注射起泡后，剪去粘膜層，直接剪取平滑肌組織，棄漿膜層及其上未剪下之肌組織。 new: 如果是不全BOO兔，則可將膀胱剪成寬約0.5cm之條狀，撕去粘膜層后，助手以一眼科鑷將該組織一端固定，眼科鑷與該組織垂直，并夾持整個橫截面，術者同法夾持于附近，助手持第3把眼科鑷提起肌組織，術者以手術刀銳性分離肌層；如此，向另一端推進，銳性分離肌條。 7.在超凈臺，取相當于0.5為X0.5 CM2肌塊，室溫下將其剪碎成1~2mm碎組織塊 8.轉移入離心管 9.加入D－h(huán)anks液(操作成功) OR Dulbecco 10.離心1000轉/min，10分鐘 離心半徑13cm，棄上清 11.加入I型膠原酶（2mg/ml） 5mg,(II型膠原酶2mg/ml 5mg也可，但效果不如I型膠原酶) 12.不要加入DMEM為主要成分的培養(yǎng)液(否則胰蛋白酶失活) 13.轉移入培養(yǎng)瓶中 14.4度下過夜孵育。 15.加0.25%胰蛋白酶 16.36.5度振蕩消化 15~30min,棄上清。(可省) 17.200目(74um)不銹鋼網過濾。(可省) 18.轉移入離心管,吹打后待可見物沉淀，吸盡沉淀（避免組織塊培養(yǎng)法） 19.離心1000轉/min，10分鐘 離心半徑13cm，棄上清 20.加培養(yǎng)液至10ml(ok) 21.轉移入培養(yǎng)瓶中 22.CO2恒溫箱中培養(yǎng) 23.12h后收集未貼壁細胞并計數(shù) 家兔椎間盤(intervertebral disc )細胞的體外培養(yǎng)方法 Material and method： Material : 1. 培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、燒瓶、試管等。 2. 分離組織需要的眼科剪子、眼科鑷子。 3. 5%CO2孵箱、PH計、95%氧氣源。 4. 36電動恒溫水浴。 5. 培養(yǎng)液、各種緩沖液及添加劑DMEM高糖培養(yǎng)基、Hank’s緩沖液 、20%胎牛血清，轉換生長因子（TGF-β1）(5ng/mL)、胰島素-轉鐵蛋白-硒（10ug/mL胰島素，5ug/mL轉鐵蛋白，和0.5ng /mL亞硒酸鹽）青霉素100U/Ml，鏈霉素100U/ml 。 6. 消化液 膠原酶(collagenase) 200U/ml 0.4%臺盼蘭、0.25胰蛋白酶 Method 1 組織塊法 1. 取材：空氣栓塞法處死家兔后，在無菌狀態(tài)下獲取家兔椎間盤組織。置于準備好的DMEM培養(yǎng)基（含雙抗）。迅速帶回到無菌超凈臺上。（注意事項：椎間盤位于相鄰兩個椎體之間，取材過程較為繁瑣，要求動作迅速，爭取在家兔死后半小時內完成，否則，該組織對缺氧耐受性差導致培養(yǎng)失敗）。 2. 剪切：在超凈臺上，進一步將周圍組織分離，用Hank’s液沖洗數(shù)遍，直到沖洗液透明為止。眼科剪刀將組織修剪為1~2cm3大小的小組織塊，Hank’s沖洗干凈。 加入少量含血清的培養(yǎng)液。(組織塊不宜過小，否則不容易爬出足夠數(shù)量的細胞) 3. 接種：用吸管吸取小組織塊入培養(yǎng)瓶底部，擺放均勻，一個25cm2的培養(yǎng)瓶可放置10-15個小組織塊，翻轉培養(yǎng)瓶，加入少量培養(yǎng)液。4~6小時后，待組織塊充分貼壁后，再翻轉回來（動作一定要輕巧，以免剛剛貼壁的組織塊脫離瓶底） 4. 置于5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔3天換液。待細胞95%融合時，0.25%胰蛋白酶傳代分瓶。 Method 2 消化法 前面步驟同組織塊法1，2。 3.組織塊再進一步剪切，此時培養(yǎng)液中最好不加血清。完畢后，加入消化液，移入到10ml 離心管，培養(yǎng)箱內消化。每隔20分鐘，用吸管吹打一次，觀察液體有否變渾濁，并取少量液體，在相差倒置顯微鏡下觀察。0.4%臺盼蘭染色計算活細胞數(shù)目。接種密度在105數(shù)量級。置于5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔3天換液。待細胞95%融合時，0.25%胰蛋白酶傳代分瓶。 鴨胚成纖維細胞原代培養(yǎng) 1．材料 1.1 10-12日齡非免疫受精鴨胚 購于雅安偏遠山區(qū) 1.2標準胎牛血清(FBS) Tianjin.h"y bio.co;ltd 1.3MEM營養(yǎng)液（細胞增殖液；細胞維持液；洗液） GIBCO Invitrogen Corporation 1.410倍胰酶 （自配） 1.5抗生素 醫(yī)用80萬單位青霉素和醫(yī)用100萬單位鏈霉素 1.6滅菌的無鈣、鎂平衡鹽溶液（自配） 2．實驗器材與儀器 2.1實驗器材 國產玻璃螺旋口細胞培養(yǎng)瓶（100ml）；培養(yǎng)皿；離心管（10ml）移液管（10ml與1ml）；漏斗；10層紗布；三角錐瓶（100ml）；吸耳；酒精燈；酒精（75%）；碘酒(3%)；火柴；瓶塞；鑷子；濾器及配套濾膜（25mm直徑 孔徑0.22um）；50ml注射器；燒杯；蛋座；記號筆；離心管架；金屬飯盒；照蛋器。 2.2 實驗儀器 儀器名稱 產地 超純水儀 Water pro ps.labconco 電子天平 ShangpingFA2004. 上海天平儀器廠 高壓滅菌儀 HIRAYAMA4 雙蒸水儀 上海亞榮生化儀器廠 Orion臺式PH測試儀 868型 OrionResearch.Inc 倒置顯微鏡 OLYMPUS 細胞培養(yǎng)箱 Queue 臺式高速低溫離心機 Beckman coultertm 超凈臺 蘇州安泰空氣技術有限公司 水浴鍋 國華電器有限公司 低溫冰箱 海爾集團 電熱恒溫鼓風干燥箱 DHG-9140型上海精宏實驗設備有限公司
3.4 原代鴨胚成纖維細胞的制備。（10×ATV消化法） 實驗前，無菌室用紫外線照射30min以上；超凈臺使用前應徹底擦干再用0.1%苯扎溴銨（新潔爾滅）擦拭一遍 。雙手和瓶子表面用75%的酒精消毒。(以下步驟參考文獻[2][4][5][6]進行的) ①取10-12日齡發(fā)育良好的鴨胚，氣室向上置于蛋盤內，用碘酒擦拭鴨蛋表面，后用酒精脫碘，并在氣室端打一小孔，沿氣室用鑷子小心剪去蛋殼露出氣囊，以鑷子去除覆蓋于絨毛尿囊摸上的白膜，暴露出尿囊膜及附著的血管。用鑷子撕開尿囊膜，夾住鴨胚頸部，移置于一小培養(yǎng)皿中。 ②去除胚的頭，四肢和內臟，用基礎營養(yǎng)液清洗2-3次，直至組織出現(xiàn)透明，倒盡清洗液。 ③用眼科剪剪碎胚體直至0.1-0.5立方毫米 。剪越碎越好。 ④移組織碎塊于三角錐瓶內，加0.2ml/胚 的10×ATV 37℃水浴鍋內溫 熱消化 2min，后用吸管移至離心管中,用離心機5000rpm 離心5min棄上清液。 ⑤加入含雙抗的10%血清的基礎營養(yǎng)液，移離心管下層組織碎塊于三角錐瓶內，由于分散的細胞在沒有胰蛋白酶的作用下，會很快聚合成小團，為減少細胞成團應不斷吹打，直至成細胞全部分散開。 ⑥取滅菌紗布疊成8-10層置于漏斗上并使中部略凹陷，以含雙抗的10%的基礎營養(yǎng)液潤濕紗布，將已吹散的細胞懸液經紗布過濾除雜。 ⑦過濾后的細胞懸液補加含有雙抗的10%血清的基礎營養(yǎng)液，按10ml裝入細胞培養(yǎng)瓶（容量為150ml的細胞瓶），將細胞瓶置于37℃細胞培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng) 。2小時后觀察細胞貼壁情況，24小時后確認無污染。一般情況，24小時后細胞可基本長成單層。 豬甲狀腺細胞原代培養(yǎng)方法 1. 材料 豬甲狀腺由錦州市屠宰場提供。F-12培養(yǎng)基（sigma公司）；胎牛血清（天津血液研究所）；胰蛋白酶（sigma公司）；膠原酶Ⅳ（sigma公司）；牛TSH（sigma公司） 2. 方法 殺豬后迅速取出甲狀腺1～2個，置于盛有75％酒精的燒杯中，用冰盒送至實驗室（1小時以內）。立即置于pH為7.4的PBS緩沖液（含青鏈霉素）中，反復漂洗，直至漂洗液清澈透明。去除包膜及結締組織，用眼科剪子、鑷子將甲狀腺組織剪成１mm3大小的碎塊。置含0.25％胰酶和300U/ml膠原酶的容器中，放于37℃溫箱中消化60min，每隔15min需搖動一次。用吸管將上清液的三分之二吸入離心管中，并加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。以 1000轉／分鐘離心10分鐘后，棄上清。將細胞沉淀用F-12培養(yǎng)基制成細胞懸液，充分吹打并用不銹鋼網（200目）過目，再1000轉／分離心10分鐘，棄上清。沉淀懸于含15％胎牛血清和１U/L牛TSH的F-12培養(yǎng)基中，臺盼藍染色證明活細胞數(shù)大于95%，調整細胞濃度接種于培養(yǎng)板中（１ml／孔）。置于37℃的5%CO2孵箱中，每二至三天換一次液，至細胞融合成片后用于實驗。 3.結果 豬甲狀腺細胞培養(yǎng)24小時，鏡下細胞貼壁，呈聚集生長，細胞呈圓形或橢圓形。 4.討論 胰蛋白酶適于消化細胞間質較少的軟組織如上皮組織、肝、腎等，對傳代細胞也非常好。但消化纖維性組織或較硬的癌組織則效果較差。膠原酶對膠原有很強的消化作用，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織等。由于甲狀腺富含纖維性組織，所以甲狀腺的消化分離一般采用膠原酶與胰蛋白酶聯(lián)合消化法，用單一的胰蛋白酶消化效果一般；促甲狀腺激素（TSH）是培養(yǎng)甲狀腺細胞必備的，它能夠起到促進甲狀腺細胞生長的作用。本人也曾嘗試過不加TSH，與加TSH對比明顯可見細胞增長較慢，且形態(tài)不好。 細胞原代培養(yǎng) 材料：小鼠 器具：飯盒、紗布、小剪子、小鑷子、大鑷子、大燒杯、平皿、研磨玻片、濾網、離心管（15/50ml）、6孔培養(yǎng)板、吸管、移液管、手套、微量加樣器 試劑：DMEM（含血清）、無血清 DMEM培養(yǎng)基、膠原酶、PBS 準備：酒精擦拭臺面后把物品擺放好，開紫外線燈照30分鐘后開鼓風機吹至實驗結束。 操作步驟： 1、將小鼠斷頸致死，置75%酒精泡 2-3秒鐘，取心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、睪丸或卵巢，置于盛有PBS的平皿中。 2、剔除脂肪、結締組織、血液等雜物, 轉移到另一個盛有PBS液的平皿中。 3、用手術剪將臟器剪成小塊（1mm2），玻片研磨，轉到離心管，離心1000rpm，5min。 4、視組織或細胞量加入5-6倍（3-5ml）膠原酶，37℃中消化20分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。 5、加入3-5ml含血清的培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用。 6、用100目孔徑濾網濾過，除去未消化的大組織塊。 7、1000rpm，離心5分鐘，棄上清液。 8、加入無血清培養(yǎng)液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。 9、加入含血清的培養(yǎng)液l-2 ml（視細胞量），血球計數(shù)板計數(shù)。 10、將細胞調整到5×105/ml左右，轉移至6孔培養(yǎng)板中，37℃下培養(yǎng)。 心肌細胞的分離及培養(yǎng) 器械：飯盒、燒杯、彎頭解剖剪（2）、小鑷子（2）、平皿（4）、毛玻片、濾網、離心管（15ml）、移液管、培養(yǎng)瓶、廢液缸、PE手套、橡膠手套、冰盒 溶液：PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶 動物：小鼠 準備：用酒精棉球擦拭臺面后把物品擺放好，開紫外線燈照30分鐘后開鼓風機吹至實驗結束，提前半小時將培養(yǎng)液、胰酶37℃溫浴。 培養(yǎng)過程： 1. 兩個圓皿中加入5ml的PBS培養(yǎng)液，將小鼠浸入70％酒精&5min，用小剪子及小鑷子開胸取心。 2. 取出的心放在一個裝有PBS的平皿中，剔除心臟周邊的血凝及纖維組織。 3. PBS再沖洗后，轉移至另一個預先裝好5ml胰酶的平皿中，用剪子將平皿中的心臟剪成1mm3的碎塊，倒入15ml離心管中，加入3-5ml胰酶沖洗平皿轉移到離心管中。 4. 放入水浴鍋中，溫和搖動，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血紅細胞、細胞碎屑和死細胞。 5. 再將8-10ml胰酶加入盛有組織的離心管，吸管輕輕吹打1min，消化10min，小心轉移上清+2ml DMEM至另一離心管中，細胞懸液離心，1000轉×10min，棄上清，加培養(yǎng)基為管1。 6. 重復第5步，3-8次，直至至組織塊消化為止。 7. 將多次細胞懸液經100目濾網過濾，混合。 8. 加入1ml DMEM重懸，顯微鏡下觀察并計數(shù)。 9. 培養(yǎng)1-1.5小時，收集培養(yǎng)液中的非貼壁細胞，小心不要晃動。 10.顯微鏡觀察并計數(shù)，細胞密度調至5×105-6×105細胞/ml。 11.4-6小時后，用培養(yǎng)基輕輕沖洗2次，加入培養(yǎng)基繼續(xù)孵育過夜。 肝細胞原代培養(yǎng) 材料：小鼠 器具：飯盒、紗布、小剪子、小鑷子、大鑷子、大燒杯、平皿、研磨玻片、濾網、離心管（15/50ml）、6孔培養(yǎng)板、吸管、移液管、手套、微量加樣器 易生物儀器庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html 易生物試劑庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html 試劑：DMEM（含血清）、無血清DMEM培養(yǎng)基、胰酶、PBS 準備：酒精擦拭臺面后把物品擺放好，開紫外線燈照30分鐘后開鼓風機吹至實驗結束。 操作步驟： 1、將小鼠斷頸致死，置75%酒精泡2-3秒鐘，取肝臟，置于盛有PBS的平皿中。 2、剔除脂肪、結締組織、血液等雜物,轉移到另一個盛有PBS液的平皿中。 3、用手術剪將臟器剪成小塊（1mm2），玻片研磨，轉到離心管，離心1000rpm，5min。 4、視組織或細胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。 5、加入3-5ml含血清的培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用。 6、用100目孔徑濾網濾過，除去未消化的大組織塊。 7、 1000rpm，離心5分鐘，棄上清液。 8、加入無血清培養(yǎng)液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。 9、加入含血清的培養(yǎng)液l-2 ml（視細胞量），血球計數(shù)板計數(shù)。 10、將細胞調整到5×105/ml左右，轉移至6孔培養(yǎng)板中，37℃下培養(yǎng)。 大鼠胰島細胞原代培養(yǎng) 一周齡Wistar大鼠，斷頸處死，于 75%乙醇浸泡15分鐘，無菌取出胰臟，于冰冷無菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔細清除脂肪、包膜、血管等胰外組織，轉入青霉素小瓶中，加入少量無菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管輕輕吸出上層細小脂肪碎塊和油滴，再用無菌D- Hanks液反復清洗8~10次，加入10倍體積無菌消化酶液[胰蛋白酶-膠原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g Ⅴ型膠原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL無Ca2+、Mg2+的 0.01mol/LPBS（pH值為7.4）溶液，用0.22μm微孔濾膜濾菌]，38℃±1℃消化，消化過程中不斷震蕩，10分鐘后吸出上面酶液棄去，用無菌D-Hanks液將組織塊清洗2~3次，加入新鮮酶液繼續(xù)消化，重復上述步驟。此時組織塊邊緣模糊，再將組織塊浸入消化酶液中，38℃±1℃消化 10分鐘，將消化酶液與組織塊分開，組織塊重新加入新鮮消化酶液進行消化；而原消化酶液1500rpm離心10分鐘，取沉淀即為消化下的細胞，重新用無菌 D-Hanks懸浮，離心，重復1~2次，再用培養(yǎng)基洗2~3次，用培養(yǎng)基懸浮即得細胞懸液；將消化過的組織塊重復消化5~6次至組織塊消化完全，重復以上操作，合并幾次所得細胞懸液，計數(shù)，調整細胞濃度為2×105個細胞/mL，將細胞懸液接種于24孔塑料培養(yǎng)板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于成纖維細胞貼壁要比胰島細胞迅速，接種15小時后，輕輕振蕩培養(yǎng)板，將上面未貼壁的細胞接入新的培養(yǎng)板中，可除去部分成纖維細胞。將新培養(yǎng)板中細胞培養(yǎng)48小時后，換新鮮配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)5小時，可除去絕大部分成纖維細胞，而胰島細胞不受傷害，換不含碘乙酸的培養(yǎng)基洗2次，并換不含碘乙酸的培養(yǎng)基在37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天換培養(yǎng)液，獲得單層胰島細胞。 視神經少突膠質細胞體外培養(yǎng)純化及鑒定 1 材料和方法 1.1 DMEM/F12條件培養(yǎng)液（亞硒酸鈉40μg·L-1，腐胺16.2 mg·L-1，轉鐵蛋白100 mg·L-1，胰島素234U·L-1，甲狀腺素0.4μg·L-1，黃體酮0.62 mg·L-1，谷氨酰胺3g·L-1）。DMEM/F12培養(yǎng)基、小牛血清購自Hyclone公司，兔抗鼠GC抗體、亞硒酸鈉、腐胺等購自Sigma公司。 1.2 視神經膠質細胞的來源、培養(yǎng) 取新生2d的Wistar大鼠10只（第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動物中心提供），無菌條件下取出雙側視神經。接種至24孔培養(yǎng)板內經多聚賴氨酸處理的蓋玻片上。而后加入含30g·L-1小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，37(C，50mL·L-1 CO2，100%濕度連續(xù)培養(yǎng)3d。3d后棄廢液，改為含5g·L-1小牛血清DMEM/F12條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每周換液2次。在獲得足夠的細胞數(shù)量后，改用無血清條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2d換液一次。 1.3 形態(tài)學觀察 每天在倒置顯微鏡（日本Olympus），觀察培養(yǎng)細胞的生長過程和形態(tài)學變化并拍照。 1.4 免疫細胞化學鑒定：將含細胞蓋玻片取出，0.01mol·L-1 PBS沖洗3次×5min；冷丙酮固定10 min；PBS沖洗（3次×5min）；30g·L-1過氧化氫室溫孵育15min；PBS沖洗3次×5min；滴加正常山羊血清，室溫孵育20 min；滴加1:100 GC抗體，陰性對照以PBS代替一抗，37(C孵育60min；PBS沖洗3次×5min；滴加生物素標記羊抗兔IgG，37(C，20min；PBS沖洗3次×5min；滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液；DAB工作液（武漢博士德公司）顯色，自來水終止反應；脫水，透明，D·P·X封片保存。 2 結果 2.1 形態(tài)學觀察結果 組織塊24ｈ開始貼壁，48～72ｈ可見神經組織邊緣游出少量細胞，主要為圓形或梭形（圖1）。8～9d左右，細胞基本鋪滿培養(yǎng)孔。此時改用無血清條件培養(yǎng)基培養(yǎng)進行純化。培養(yǎng)過程中，部分細胞死亡。12d左右獲得的細胞胞體基本為呈圓形或多角型，直徑約6～10μm。細胞核較大，胞質少（圖2）。 2.2 免疫組織化學染色結果 培養(yǎng)的視神經少突膠質細胞的免疫組織化學染色GC蛋白陽性，未加一抗的呈陰性。染色結果顯示成熟的少突膠質細胞突起豐富，互相形成蜘蛛網狀（圖3）。蘇木素復染，異質細胞較少，90%以上為陽性細胞. 3 討論 抑制神經再生基因Nogo的發(fā)現(xiàn)為視神經損傷的修復、視功能保護研究帶來了希望。視神經膠質細胞包括星形膠質細胞和少突膠質細胞2種類型,分化不同,功能各異。成熟的少突膠質細胞不再具有分裂增殖能力，為分裂終期細胞[2]，培養(yǎng)較為困難。 1980年 McCarthy[3]等建立了從腦灰質組織分離、純化星形膠質細胞和少突膠質細胞的分離培養(yǎng)模型。目前國內外多采用該法[4]。利用少突膠質細胞和星形膠質細胞貼壁能力的不同采用振動分離法進行分離、培養(yǎng)。此法主要用來獲取星形膠質細胞，獲得的少突膠質細胞較少。存在著操作步驟多容易被污染、分離過程中因振蕩離心易造成機械性損傷導致細胞死亡等缺點。 本實驗采用視神經組織塊培養(yǎng)的方法，對新生大鼠的視神經膠質細胞進行條件化原代培養(yǎng)，利用少突膠質細胞和星形膠質細胞生長條件的不同，采用條件培養(yǎng)基純化2種細胞。少突膠質細胞和Ⅱ型星形膠質細胞是從一種普通雙潛能的少突膠質細胞－2型星形膠質細胞祖細胞（oligodendrocyte-type-2astrocyte progenitor cell，O2A）發(fā)育而來[2]。大鼠出生后約1周，少突膠質細胞逐漸成熟。因此，從新生大鼠取材可獲得O2A祖細胞。體外研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺素、胰島素、轉鐵蛋白、腐胺、黃體酮和微量元素硒等，可使O2A祖細胞朝少突膠質細胞定向分化。而血清等可以誘導O2A祖細胞分化為Ⅱ型星形膠質細胞[2、5]。我們利用這一特點，逐步減少條件培養(yǎng)基中的血清濃度，促進O2A祖細胞向少突膠質細胞分化。最終采用無血清條件培養(yǎng)基，抑制星形膠質細胞及其它異質細胞增殖，而少突膠質細胞在此條件下則基本不受影響。GC是表達于少突膠質細胞膜以及髓鞘的一種主要類脂，它是識別少突膠質細胞普遍應用的特異性化學標志物[2、 4]。免疫染色鑒定結果表明純度較高超過90％。此方法簡便、可靠、易于推廣，便于對少突膠質細胞相關課題進行研究。 軟骨細胞培養(yǎng) 軟骨細胞的原代培養(yǎng) 齡新西蘭乳兔(雌雄不限，共18只，分6次處理),溺死，置于75%酒精溶液中10分鐘，拿入超凈工作臺，自眼外眥至耳屏前剪開皮膚暴露皮下組織，再次嚴格消毒，自外眥外將顴弓由根部剪斷，暴露髁狀突，去凈髁狀突表面軟組織及軟骨膜，以眼科剪剪取髁狀突表面的透明軟骨，以磷酸緩沖液（PBS含青霉素、鏈霉素各100U/L）沖洗2遍，將軟骨剪切成1－3mm3 左右碎塊，0.25%胰蛋白酶先消化 30-35分鐘，PBS浸洗2遍；后置于50ml玻璃培養(yǎng)瓶，加0.1%Ⅱ型膠原酶(DMEM配制)，37消化3.5－4.5小時，每小時置37℃恒溫振蕩箱振蕩5min。直到軟骨塊大部分呈肉眼可見的絮狀物，倒置顯微鏡下觀察，軟骨細胞大部分分離后，以彎頭吸管輕輕吹打，細胞懸液以1200r/min離心7分鐘，棄上清，以含10％新生牛血清DMEM的培養(yǎng)液終止消化，離心棄上清以洗去細胞表面的酶，懸浮細胞并計數(shù)，臺盼藍染色檢測細胞活力為90％。將細胞以2×105/ml接種于25cm2培養(yǎng)瓶內，置于37 ℃恒溫, 5%CO2 濃度,飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。2天后換液1次，以后隔天更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡觀察、照相記錄細胞形態(tài)及貼壁生長情況。待細胞貼壁達到85%－90%后傳代。 軟骨細胞的傳代培養(yǎng) 待細胞貼滿壁后傳代。傳代時,吸干培養(yǎng)液,用PBS液輕洗細胞2次，培養(yǎng)皿內加入0.25%胰蛋白酶－0.01%EDTA（1比1）消化液,以覆滿瓶底為限,置溫箱2～3 min 后,顯微鏡下觀察到細胞質已回縮,細胞間隙增大，即向培養(yǎng)皿里滴入2 mL 左右含血清的培養(yǎng)液終止消化,收集第1代培養(yǎng)細胞，用彎頭吸管吸取混和液,反復多次輕吹皿底細胞,使細胞徹底從培養(yǎng)瓶底壁脫落,收集細胞混和液, 1200r/min離心7分鐘, 棄上清，以含10％新生牛血清的DMEM清洗細胞3次,制成細胞懸液，將細胞以2×105/ml 接種于25cm2培養(yǎng)瓶內，置于37 ℃恒溫, 5%CO2 濃度,飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。隔天更換DMEM培養(yǎng)液。以第3代軟骨細胞制成細胞懸液并計數(shù)，臺盼藍染色檢測細胞活力為90%，調整細胞濃度為5×107/ml, 用于實驗。 傳代 吸干培養(yǎng)液,用PBS 液輕洗細胞2次,培養(yǎng)皿內加入0.25 %的胰蛋白酶,以覆滿皿底為限,置溫箱2～3 min 后,顯微鏡下觀察到細胞質已回縮,細胞間隙增大,少部分細胞已浮于消化液中,用吸管吸取混和液,反復多次輕吹皿底細胞,使細胞徹底從培養(yǎng)皿底壁脫落,收集細胞混和液,離心,用PBS 液漂洗2 次,再制成細胞懸液,計數(shù),檢查細胞活力,按每個培養(yǎng)皿接種2 ×105 個細胞再培養(yǎng)。 兔膀胱平滑肌細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 一、摘要 目的：建立兔膀胱平滑肌細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定的方法。方法：成年新西蘭白兔兩只（正常及梗阻各一只），采用酶法分離技術獲得膀胱平滑肌細胞后于10%小牛血清的DMEM中培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)和擴增情況，用爬片染色、電鏡、蛋白質α-肌動蛋白（α-actin）鑒定細胞類型。結果：倒置顯微鏡下觀察均呈 “谷和峰”樣結構、細胞爬片HE染色及電鏡檢查均證實為平滑肌細胞。免疫組化染色檢測α-actin呈陽性反應。從細胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測 α-actin呈陽性反應中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細胞的純度幾乎99%。結論：該方法易行、可靠、在短期內可獲得大量高純度膀胱平滑肌細胞。 二、 材料及方法 1、 試劑及標本 成年同齡雄性新西蘭白兔2只，體重約2.5~3k(購于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動物實驗中心)，一只為正常成年雄性新西蘭白兔，一只為膀胱出口不全梗阻8周成年雄性新西蘭白兔。DMEM、Ⅱ型膠原酶及α-肌動蛋白抗體（α-actin）購于北京華美公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；胰蛋白酶購于南京生興公司。 2、 膀胱平滑肌細胞酶法分離 肌注鹽酸氯胺酮200mg及氟哌利多 5mg麻醉，待兔進入麻醉狀態(tài)后消毒，下腹正中切口，迅速切取膀胱組織。超凈臺內依次慶大霉素溶液（濃度為100單位/毫升）、生理鹽水及D-Hanks 液中浸泡洗滌5分鐘，然后放入D-Hanks液中除去黏膜、黏膜下及漿膜層。肌肉剪成肉糜后0.1%膠原酶（Ⅱ型2mg/ml）溶液40過夜消化（約 10-12小時）。然后加0.25%胰蛋白酶370消化30分鐘，消化液變混濁呈絮狀提示消化良好。用100目細胞篩過濾該絮狀液，混懸液離心（1000 轉/分，離心半徑13cm）5分鐘，沉淀的細胞移入培養(yǎng)皿，加入含10%胎牛血清的DMEM，置于50ml/L CO2、37度飽和濕度孵育箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)液每周更換2-3次。 3、 傳代培養(yǎng) 待培養(yǎng)的細胞通過增殖達到約80%匯合狀態(tài)時做傳代處理。棄去原培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，加入適量的PBS(因培養(yǎng)液中的胎牛血清對胰蛋白酶有抑制作用)，輕輕搖動，清洗殘留的培養(yǎng)液后棄之。加入適量的消化液，使其覆蓋整個細胞，將培養(yǎng)瓶放置于CO2培養(yǎng)箱，不時在倒置顯微鏡下觀察，當細胞胞質回縮，胞間間隙增大后，吸出消化液，并向培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁制備細胞懸液，吹打時不能用力過猛，盡量不出現(xiàn)氣泡，以免損傷細胞。細胞進行計數(shù)后，按照1X105~106密度將細胞接種于培養(yǎng)瓶中。 4、 培養(yǎng)細胞的觀察及鑒定 采用倒置顯微鏡觀察平滑肌細胞的形態(tài)及生長情況。細胞爬片HE染色觀察細胞形態(tài)。電鏡檢查。免疫組化染色檢測α-actin。 結果 兩只兔所有標本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細胞24小時均可見膀胱平滑肌細胞貼壁生長，正常兔7天左右、而梗阻兔則需10~12天可于50毫升培養(yǎng)瓶約80%匯合。均傳代順利，傳代后約正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9天可于50毫升培養(yǎng)瓶約80%匯合。本組中均傳至第8代，經第8次傳代后，平滑肌細胞仍生長迅速，未見衰老跡象。倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結構（圖1 對照組2周的細胞；圖2 實驗組培養(yǎng)2周的細胞）。細胞爬片HE染色見膀胱平滑肌細胞細胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細胞核型(見圖3)。電鏡檢查可見平滑肌細胞密班結構（圖4分離后培養(yǎng)細胞的電鏡檢查發(fā)現(xiàn)平滑肌細胞致密班結構）。免疫組化染色檢測α-actin呈陽性反應（圖5）。從細胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測α- actin呈陽性反應中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細胞的純度幾乎99%。 三、 討論 平滑肌細胞的培養(yǎng)方法可分為兩類：組織塊法和酶消化法。組織塊法適用于細嫩、易碎的組織；其方法較簡單；但容易產生雜質如成纖維細胞等，成纖維細胞生長快，故培養(yǎng)之細胞質量較差；培養(yǎng)的大多數(shù)細胞無收縮性；且原代細胞的獲得需3~4周，獲得大量平滑肌細胞耗時長（17）。既往酶消化法較組織塊法復雜、精細；適宜的酶濃度和培養(yǎng)時間的確定較為困難；然而在較短時間內可獲得大量的平滑肌細胞，1996年有學者報道（Chambers（18）等）酶消化法純度為 70%。可見一種快速、高效、高純度的酶消化法培養(yǎng)膀胱平滑肌的方法顯得尤為重要。 本實驗研究兩只兔所有標本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細胞24小時均可見膀胱平滑肌細胞貼壁生長，正常兔7天左右、而梗阻兔則需10~12天可于50毫升培養(yǎng)瓶約80%匯合。均傳代順利，傳代后約正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9天可于50毫升培養(yǎng)瓶約80%匯合。本組中均傳至第8代，經第8次傳代后，平滑肌細胞仍生長迅速，未見衰老跡象。倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結構。細胞爬片HE染色見膀胱平滑肌細胞細胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細胞核型。電鏡檢查可見平滑肌細胞密班結構。免疫組化染色檢測α-actin呈陽性反應。從細胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測α-actin呈陽性反應中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細胞的純度幾乎 99%（在以下的膀胱平滑肌細胞的共聚焦檢測中也證實了這一點）。 膀胱平滑肌的鑒定（10）主要根據(jù)其細胞形態(tài)及α-actin的檢測。倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結構；細胞爬片HE染色見膀胱平滑肌細胞細胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細胞核型；電鏡檢查可見平滑肌細胞密班結構，這些細胞形態(tài)學的檢測均證實其為膀胱平滑肌細胞。免疫組化染色檢測α-actin呈陽性反應更進一步證實了該方法所獲得的細胞為膀胱平滑肌細胞。已有學者通過實驗發(fā)現(xiàn)：酶消化法獲得的膀胱平滑肌細胞細胞膜通道的密度有所下降；細胞膜電位和細胞膜電阻稍微降低。他們認為通過酶消化法所獲得的膀胱平滑肌細胞經培養(yǎng)、傳代后仍基本保持著原有的電生理特性，由此在體外研究的結果可較好的反映體內情況（21）（20）。梗阻后的膀胱平滑肌細胞在生長擴增中明顯較正常膀胱平滑肌細胞時間長，也說明了這種酶消化法對膀胱平滑肌細胞的影響不是太大，還是保留著體內的基本特性。在我們的激光掃描共聚焦顯微鏡的檢測中平滑肌細胞內的鈣離子熒光強度在M受體激動劑的影響下發(fā)生明顯變化，這更進一步證實了該方法分離培養(yǎng)出的膀胱平滑肌仍保持著收縮功能。 從實驗研究中我們體會到該方法：1、簡便、易行、易掌握及短期內可獲大量高質單個膀胱平滑肌細胞；2、應嚴格無菌操作；3、仔細徹底剝除膀胱黏膜、黏膜下及漿膜層，是確保獲的大量高質單個膀胱平滑肌細胞的基礎；4、膀胱平滑肌組織應盡量減碎以確保充分消化；5、嚴格控制膠原酶和胰蛋白酶的濃度和消化時間，見消化液混濁、組織塊呈絮狀，或在倒置顯微鏡下見消化液中有較多單個細胞或細胞小團塊時即終止消化；6、細胞篩的運用也是獲得高質單個膀胱平滑肌細胞的基礎。 1. Chamley CJ,Campbell GR,Ross R.The smooth muscle cells in culture.Physiol Rev 1979 59（1）:1-61. 2. Chambers P,Neal DE,Gillespie JI.Ca2+ signalling in cultured smooth muscle cells from human bladder .1996 Exp Physiol 81 (4):553-564. 3．Korkmaz M, Guvenc BH, Bilir A et al. Isolation and culture of adult and fetal rabbit bladder smooth muscle cells and their interaction with biopolymers.J Pediatr Surg. 2003 Jan;38(1):21-24. 4.Sui GP, Wu C, Fry CH .A description of Ca2+ channels in human detrusor smooth muscle. BJU Int. 2003 Sep;92(4):476-478. 5. Sui GP, Wu C, Fry CH. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells.J Urol. 2001 Feb;165(2):627-632. SD大鼠VSMC的原代培養(yǎng)(貼塊法) 實驗材料：手術剪1把、手術鉗2把、眼科剪刀2把 、眼科鑷子1把 、大頭針4個、手術刀片、無菌1×PBS約500ml 20%FBS的DMEM、5ml小皿3個、 10ml大皿1個、殺鼠板1塊。（以上均為無菌物品） 實驗步驟 1、 150-200gSD-大鼠，短頭，浸入75%的酒精中15min 2、 置入超凈臺中，將大鼠固定于殺鼠板上，在無菌條件下打開腹腔，分離出胸主、腹主，摘出。 3、 PBS清洗3遍，剝去外膜，用手術刀片刮去內膜，留下中膜并將其移入1ml的培基中、剪成1×1mm大小組織塊。 4、再將PBS清洗組織塊，移入25ml 的培養(yǎng)瓶中，用尖嘴彎管均勻貼好組織塊，放入37度5％CO2的培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)6小時后，待組織塊貼壁后，再加入2.5ml培養(yǎng)液后放回37度5％CO2 的培養(yǎng)箱中。注意：最后加入2ml培養(yǎng)液時應使其順無組織塊的皿邊緣緩慢流下，勿使組織塊吹下。 5、 隨后每3天予以全量換液。 6、 3-5天后可見組織塊周圍有細胞爬出，大約2周后80％融合。 本人曾做過3個月的SD大鼠VSMC的原代培養(yǎng)，基本上的所有的障礙都遇到過，現(xiàn)在已做的相當成功，并樂意與大家分享經驗！ 脾臟單個核細胞懸液的制備 (1) 大鼠斷頸處死后，無菌取脾置于消毒平皿中稱重 (2) 超凈工作臺上置10cm直徑無菌平皿，加入5～10ml D-hanks平衡液 ，置一80目的不銹鋼篩于平皿中，脾臟置于篩網中，用剪刀剪碎脾，用5ml玻璃注射器針芯輕輕捻磨脾臟，使分散的細胞濾過金屬網進入平皿的液體中， D-hanks沖洗一次； (3) 用吸管吸取沖洗液，200目的鋼篩過濾一次后收集至離心管中； (4) 1000rpm，離心5～10min，棄上清； (5) 加入約1ml雙蒸水，吸管打勻后20s后加入等量的1.8%的NaCl溶液，然后加入大量D-hanks調節(jié)滲透平衡，以***紅細胞，但對白細胞沒有影響； 用D-hanks液洗滌細胞2～3次，用含有1mM/L的谷氨酸胺、100IU/ml青霉素G、100μg/ml鏈霉素、 10%的胎牛血清的RPMI－1640重懸細胞，調節(jié)細胞濃度為5×106/ml，臺盼蘭染色檢測細胞存活率大于95％； (7) 接種至培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。 豬肺泡巨噬細胞的培養(yǎng) 1、細胞培養(yǎng)所用溶液及其配制 1×RPMI1640及：按照產品說明配制，過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p> 新生牛血清：56℃滅活 30min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p> 2×104U/ml青、鏈霉素液（雙抗）：青鏈霉素各2×106 U溶于100ml滅菌雙蒸水中，過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p> 10×Na2EDTA-胰酶溶液（2.5%）：Na2EDTA 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g ，Na2HPO4.12H2O 2.89g，KH2PO4 0.2g，1%酚紅溶液1.5ml，胰酶（1:250）2.5g，溶于100ml雙蒸水中，NaOH調節(jié)pH至7.2~7.5，過濾除菌，分裝，-20℃ 保存?zhèn)溆茫褂脮r1∶10倍稀釋。 7.5%NaHCO3： 7.5g NaHCO3溶于100ml雙蒸水中，115℃高壓滅菌15min，置4℃冰箱冷藏備用。 10% RPMI1640營養(yǎng)液：于1×RPMI1640溶液中加入10%小牛血清，按照1% 比例加入2×104U/ml雙抗，用0.5% NaHCO3或10% HCl溶液調節(jié)pH值至7.2~7.4。
2、將50日齡的SPF仔豬放血，結扎氣管后無菌摘取其肺臟，先用0.9%的生理鹽水洗滌外表面，將pH7.2的PBS30.0ml從氣管灌入肺臟，輕輕拍打肺表面，1~2min后回收灌洗液，如此反復進行，直至灌洗液清亮為止。將回收的支氣管肺泡灌洗液用吸管輕輕吹打，將細胞團塊打散，用單層無菌100目不銹鋼篩過濾，收集全部灌洗液，2000r/min離心10min，收集沉淀。洗滌兩次后加入適量含10%胎牛血清的1×RPMI1640營養(yǎng)液吹散細胞，置培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中于37 度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其貼壁后棄去上清及非黏附細胞繼續(xù)用含10%胎牛血清的1×RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)備用。 神經細胞培養(yǎng) 一．設備： 無菌操作設備。 二．大型設備CO2培養(yǎng)箱：恒溫5%、10%CO2維持培養(yǎng)液中pH值。 倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細胞生長情況。 解剖顯微鏡，用于準確地取材。 常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養(yǎng)液，解剖液和鼠尾膠。 低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲存血清酶，貴重物品和試劑。 電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。高壓消毒鍋：用于消毒培養(yǎng)皿，手術器械。 過濾器：配制解剖液、培養(yǎng)液，必須過濾后才可使用，以去除細菌。 滲透壓儀，pH劑，天平等. 三．培養(yǎng)器皿及手術器械 1.培養(yǎng)皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。 2.培養(yǎng)板，24-40孔，可用于開放培養(yǎng)。 3.培養(yǎng)瓶； 4.吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。 5.各類培養(yǎng)液貯存器。 6.小型手術器械。 準備： 一.配制培養(yǎng)液 （1）解剖液：以無機鹽（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配制成PBS 緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。 （2）基礎培養(yǎng)基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。 （3）接種培養(yǎng)液：用于胰酶消化后的細胞分散，做成細胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當天配制。 （4）維持培養(yǎng)液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營養(yǎng)物質。 二.培養(yǎng)基質 常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再涂膠 三.消毒培養(yǎng)皿的備用。所有培養(yǎng)器皿均需清水沖洗2-3d，達兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養(yǎng)前1天進行。
神經細胞分散培養(yǎng) （一）選材 常用胚胎動物或新生鼠神經組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚，則黑質以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細胞成活率高，顆粒細胞正在分化；脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng)，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經成活率高。 （二）取材。腦則取出相應組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側，分別培養(yǎng)。 （三）細胞分離與接種。神經組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細口吸管吹打細胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細胞懸液，計數(shù)，預置細胞密度，接種于培養(yǎng)皿（1×106），做電生理應為5×105或更低。 （四）抑制膠質細胞生長。培養(yǎng)3-5d后，也有人認為培養(yǎng)7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經膠質細胞的生長。 大鼠心室肌微血管內皮細胞的原代培養(yǎng) 材料和方法 1. 儀器： 手術器械一套，倒置顯微鏡（Leica）,CO2細胞孵育箱（Heraeus），超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），掃描電子顯微鏡（Hitachi）。 2. 主要試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Hyclone，杭州四季青生物工程材料公司），胰蛋白酶、EDTA（Ameresco）；小鼠抗人CD105單克隆抗體（NeoMarkers），兔抗人CD34、CD31多克隆抗體（Antibody Diagnostica Inc），兔抗人vW因子多克隆抗體（華美公司），抗兔及抗鼠ABC試劑盒、DAB顯色試劑盒為華美公司產品，其他試劑均為國產分析純以上級別。 3. 方法 3.1 植塊法原代細胞培養(yǎng)[1]： 細胞培養(yǎng)瓶的處理[2]：選用50ml玻璃培養(yǎng)瓶，高壓蒸汽滅菌，瓶底鋪自制鼠尾膠（制作方法參見2），移入80℃烤箱烤干，臨用前用消毒D-Hanks平衡鹽緩沖液沖洗3次。 選用80克SD大鼠（雌雄不限，購自復旦大學實驗動物部），1%戊巴比妥鈉（1ml/100g）腹腔注射麻醉，75%酒精浸泡5min消毒，將大鼠移至超凈臺進行操作，止血鉗固定四肢，逐層打開胸腔，暴露心臟，剪開心包，由升主動脈處剪下心臟，放入D-Hanks平衡鹽緩沖液中，沖凈心腔中的血液，辨清心臟解剖結構，去除大血管、左右心房以及右心室和室間隔，保留左心室，小心去除心內膜及心外膜，用眼科剪剪碎余下的心室肌約2mm見方，滴加1ml進口胎牛血清，均勻接種于處理過的50ml培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞孵育箱靜置培養(yǎng)，使其貼壁，4小時后追加20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液4.5ml/瓶，約48小時后組織塊周圍有星形細胞長出，80至96小時組織塊周圍有大量細胞長出，去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)36-48小時，待細胞匯合鋪滿瓶底后用含0.125%胰蛋白酶、0.02%EDTA的消化液消化細胞進行傳代，取用第二代細胞進行進一步鑒定和實驗。 （五）觀察。接種6-12h，開始貼壁，并有集合現(xiàn)象，細胞生長突起明顯，5-7d膠質細胞增生明顯，7-10d膠質細胞成片于神經細胞下面，形成地毯，2周時神經細胞生長最豐滿，四周暈光明顯，一個月后，有些神經細胞開始退化，變形，甚至出現(xiàn)空泡，一般培養(yǎng)2-4周最宜。 但神經細胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會有細胞周期，而且隨培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量在下降，但膠質細胞可以，神經膠質細胞也可以。在培養(yǎng)過程中，早期9-12d時，有較多的神經細胞死亡，這是第一次死亡階段，應注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長而多，且相互形成突觸。 骨髓基質細胞的原代 材料方法 1. 材料： 1.1材料來源：取自健康成人行骨髓內固定術擴髓前收集骨髓腔內骨髓。 1.2主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、β-甘油磷酸鈉（β-GP）、維生素C、青鏈霉素 、胰蛋白酶（1:250）-EDTA 1.3主要儀器設備 雙人超凈臺 Farma Scientific美國 、單人超凈臺 Farma Scientific美國、二氧化碳孵箱、Farma Scientific美國、低溫冰箱 Farma Scientific美國、倒置相差顯微鏡 Nikon 日本、細胞培養(yǎng)皿35Ф Corning 美國、6孔、96孔培養(yǎng)板 Corning 美國 2. 方法 2.1原代細胞培養(yǎng)：于髓內釘內固定術擴髓前，用肝素化后的注射器抽取3-5ml骨髓，置入預裝有DMEM培養(yǎng)液的無菌 50ml離心管帶至實驗室。1000rpm離心10分鐘棄上層脂肪，取沉淀細胞加入適量DMEM， 22G針頭吹打成單細胞懸液，細胞計數(shù)后按所需濃度接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，加入完全培養(yǎng)液（含青鏈霉素各100u/ml,體積分數(shù)10%的胎牛血清、β- GP 10mmol/L、維生素C 50ng/ml、高糖DMEM）置于37℃,含體積分數(shù)5%的CO2 濕化空氣孵箱中培養(yǎng)，3天后半量換液，以后隔日全量換液，倒置相差顯微鏡每日觀察細胞生化情況。 2.2傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)至7-8天，細胞接近80%融合倒出培養(yǎng)液，1×PBS清洗兩遍，用0.25%胰蛋白酶加 0.02%EDTA消化細胞2分鐘，鏡下觀察至細胞分離脫壁后，立即加入完全培養(yǎng)液終止消化，細胞刮刀刮除細胞，將瓶內液體吸入離心管，1000rpm離心10分鐘，棄上清，加入完全培養(yǎng)液將細胞重懸，并混合均勻計數(shù)后接種于培養(yǎng)皿，行傳代培養(yǎng)。 胚胎小鼠紋狀體神經干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定 ①原代細胞的培養(yǎng)：取孕13.5天昆明種二級孕小鼠，引臼脫頸處死,碘酒、乙醇消毒腹部,逐層剖開腹部皮膚、肌肉、腹膜，取出子宮,放入盛有D1-SGH液的器皿中。仔細剝離胎膜、羊膜，暴露胎鼠，剪開顱骨，取出胎鼠腦組織并轉移至另一盛有D1-SGH液的器皿中，體視顯微鏡下剝離腦膜,分離胎鼠紋狀體，仔細剝離血管及腦膜，將收集到的紋狀體在D-hanks液中漂洗兩次，置于盛有 4℃D-hanks液的器皿中，用虹膜剪將組織剪碎,加入0.125℅的胰酶消化(37℃，15min)，期間每隔5min震蕩一次。500轉離心 5min, 棄上清，D-hanks液清洗兩次，將沉淀細胞重懸于增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基成分：DMEM/F12（1：1），2% B27 supplement，青霉素、鏈霉素各100U/ml，EGF 20 ng/mL，b-FGF 10ng/mL。用火焰拋光的吸管反復吹打，分散組織制成單細胞懸液，吸取9滴細胞懸液、1滴0.4℅臺盼藍溶液混合，用血細胞計數(shù)板在3分鐘內計數(shù)出活細胞和死細胞（臺盼藍排斥法），調整細胞密度，以105個/ mL接種75mL培養(yǎng)瓶中（NUNC）, 于5℅CO2 培養(yǎng)箱, 37℃培養(yǎng)。期間倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況。 ②傳代培養(yǎng)：當神經球直徑大約100um時收集細胞于離心管中，600轉離心5分鐘，棄上清，加入無血清培養(yǎng)基重懸細胞，吸管輕輕吹打細胞，使之形成單細胞懸液，計數(shù)后以104個/ mL接種75mL培養(yǎng)瓶中，于5℅CO2 培養(yǎng)箱, 37℃培養(yǎng)，完成一次傳代。此后每隔兩天半量換液，5-7天機械分離細胞傳代1次。期間倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況。 兔晶狀體上皮細胞培養(yǎng)方法和體會： 1、原代培養(yǎng)：健康成年白家兔空氣栓塞處死,立即取出眼球,1∶1000慶大霉素生理鹽水沖洗干凈,置超凈工作臺無菌操作。角膜緣剪開去除角膜、虹膜,將晶狀體前囊膜連同赤道部囊膜撕下,Hank液沖洗,剪成1mm×1mm小塊,上皮面向下置25mL組織培養(yǎng)瓶內貼壁培養(yǎng)。把培養(yǎng)瓶輕輕翻轉,加入適量的加入含15%胎牛血清的DNEM營養(yǎng)液,囊膜片在瓶內的上面而培養(yǎng)液在下面。置于37℃、5%CO2、95%空氣、100%濕度的CO2培養(yǎng)箱中孵育4-6h左右,待囊膜片貼壁后再將培養(yǎng)瓶調回原位,此時培養(yǎng)液覆蓋囊膜片而不使囊膜片漂浮,每周換液2次。晶體上皮細胞在接種3天后,在倒置顯微鏡下可見,植塊邊緣有新生的細胞爬出,細胞呈規(guī)則六邊形,大小均勻,胞質透明。一周后可融合成小片細胞。二周后可長滿融合成單層細胞。細胞多為類圓形、多角形。 2、傳代培養(yǎng)：細胞鋪滿瓶底或生長到一定密度時,用0.25%胰蛋白酶消化,1∶2傳代培養(yǎng)。傳代時在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底放置適當大小的蓋玻片,細胞生長其上,便于光鏡及免疫組化觀察。細胞一般24h內貼壁,約3～4d細胞可達融合,融合的細胞和原代相似,大小基本一致。傳代超過4～6代時,細胞的增長顯著下降,轉變成成纖維細胞形、三角形和長形。 3、個人體會：晶狀體上皮細胞位于晶狀體前囊膜及赤道部囊膜下，單層排列，沒有其他細胞成分，是絕對的單一細胞培養(yǎng)。但細胞數(shù)量少較難貼壁。所以采用先置于培養(yǎng)瓶待其貼壁后翻轉浸入培養(yǎng)液。另外要注意將囊膜剪小，上皮面向下，操作時有點難度的。培養(yǎng)基沒什么特別的，用小牛血清也可以，但生長較慢。一般把多個囊膜置于同一培養(yǎng)瓶加大組織密度，效果較好。 |
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