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lonza 無血清 培養基 網址鏈接http://bitebo.com/a/gb2312/gongsixinxi/shichanghuodong/2013/0331/5024.html
一、 細胞培養基的概念和原理 細胞培養基是人工模擬細胞在體內生長的營養環境，是提供細胞營養和促進細胞生長增殖的物質基礎。培養液或培養基的含義幾乎相同，英文都是medium。當它是粉劑時，傾向性地稱為培養基，而將粉劑配成液體后，多稱為培養液。培養液中常常補加血清、抗生素等成分。培養基主要包括天然細胞培養基、合成細胞培養基和無血清細胞培養基等。
天然細胞培養基是人們早期采用的細胞培養基，直接取自于動物組織提取液或體液，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。營養價值高，但成分復雜，差異大、不穩定，來源也受到限制。水解乳蛋白和膠原是兩種較好的天然培養基，富含氨基酸。血清是天然培養基中最有效和最常用的培養基，但其組成成分復雜，其中一些成分與功能不明確。血清的來源有胎牛血清、小?；虺膳Ｑ濉ⅠR血清、雞血清、羊血清及人血清，最廣泛應用的為胎牛血清和小牛血清。
合成細胞培養基是用化學成分明確的試劑配制的培養基，組分穩定，主要包括糖類、必需氨基酸、維生素、無機鹽類等。自1950 年199 細胞培養基問世以來，合成細胞培養基發展至今已有幾十種，除了沿用半個世紀的基礎合成細胞培養基之外，近年來還出現了營養成分更加豐富的低血清細胞培養基。由于細胞種類和培養條件不同，適宜的合成細胞培養基也不同，在動物細胞培養中最常用基礎細胞培養基有6～7 種，如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、199 等。由于天然培養基的一些營養成分不能被合成細胞培養基完全代替，因此一般需在合成細胞培養基中添加5％～10％的小牛血清。小牛血清的加入對細胞培養非常有效，但小牛血清的成分復雜，這對培養產物的分離純化和檢測會帶來一定的不便，為減少小牛血清的影響，開發了營養成分更加豐富的低血清細胞培養基，可以將小牛血清的使用量降低到1～3％。
無血清細胞培養基（serum free medium， SFM）是指在使用中無需添加血清的細胞培養基，且其組成成分不含有任何動物組分。按照其組分分類，還可以分為無動物組分無血清細胞培養基和化學限定無血清細胞培養基，前者組分中可能含有某些植物來源成分，而后者完全由化學成分明確的組分組成。其中，無動物組分無血清細胞培養基是目前在生物制藥行業中應用最廣泛的，它提高了細胞培養的質量，避免了使用血清帶來的麻煩。目前，已有多種無血清培養基上市，如雜交瘤細胞無血清培養基、CHO細胞無血清培養基、Vero細胞無血清培養基和NS0 細胞無血清培養基等。無血清培養基通常添加生長附加成分，如激素與生長因子、低分子營養成分和轉鐵蛋白等促細胞生長的附加成分，一般包括胰島素、孕酮、硒酸鈉、腐胺、轉鐵蛋白等。
細胞培養基是細胞培養的基礎，它為動物細胞的健康快速成長提供營養物質。所以只要用到細胞來制造生物技術產品，細胞培養基的重要作用就無可替代。 二、細胞培養基的種類與基本成分 2.1 天然培養基
天然培養基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養技術建立早期，體外培養細胞都是利用天然培養基。但是由于天然培養基制作過程復雜、批間差異大，因此逐漸被合成培養基所替代。
2.1.1 小牛血清
用于細胞培養的血清主要是牛血清，培養某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養細胞的原因主要是來源充足、制備技術成熟、經過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。小牛血清取自出生10～30 天的小牛；新牛血清取自出生24小時之內的新生牛；胎牛血清應取自剖腹產的胎牛。顯然，胎牛血清是品質最高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。牛血清對絕大多數哺乳動物細胞都是適合的，但并不排除在培養某種細胞時使用其他動物血清更合適。牛血清中含有豐富的細胞生長必須的營養成份，具有極為重要的功能。
1) 血清主要作用
(1) 提供基本營養物質：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質。
(2) 提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質激素（氫化可的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。
(3) 提供結合蛋白：結合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。
(4) 提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷，對培養中的細胞起到某些保護作用。
2) 優點和缺點
血清是非常復雜的混合物，成分多樣，含有各種生理平衡的分子量差別很大的生物分子，有的對細胞生長有促進作用，如含有攜帶激素、礦物質、微量元素和脂類物質的轉運蛋白等。血清能夠提供細胞貼壁因子和擴散因子。血清中含有起穩定作用和解毒的因子，能夠維持培養基的pH 值并抑制蛋白酶直接或間接的酶解。但是血清的加入也帶來了很多問題：
(1) 血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識，這給研究工作帶來許多困難；
(2) 血清都是批量生產，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實驗的標準化和連續性受到限制；
(3) 不能排除血清中含有易變物質，這被認為是“瓶中惡化”的原因之一。
(4) 對大多數細胞，在體內狀態，血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞）同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）。
(5) 血清含一些對細胞產生毒性的物質，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。
(6) 取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產生潛在影響。
(7) 血清的使用使得實驗和生產的標準化困難，其中的蛋白質使得某些轉基因蛋白生物藥品生產中分離純化工作很難完成。
(8) 大規模生產中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構成生產成本的主要部分之一。
(9) 為了使與傳染源相關的風險減少到最低，存在多個國家間限制進出口生物材料的國際法規。
2.1.2 水解乳蛋白
水解乳蛋白（Lactalbumin Hydrolysate ）為乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解的產物，含有豐富的氨基酸。既可用于細菌微生物培養，又可用于動物細胞培養。細胞培養中一般為0.5％水解乳蛋白（經平衡鹽溶解）與合成培養基（如MEM）按1:1混合使用。目前在生產中主要用于低鼠腎細胞等細胞的培養和維持。但是水解乳蛋白的使用也給生物制品的生產帶來一定的風險。首先由于水解乳蛋白系或者制品帶來風險。其次水解乳蛋白及含有動物組分培養基的使用，使生物制品下游處理變得復雜，這對于蛋白質藥物顯得更加重要。因為從動物細胞中生產生物藥品，其面臨的最大困難就是如何去除內源或同源蛋白。不確定的成分，像動物肽類物質的引入，勢必會增加提取、分離、純化的步驟，一方面使成本提高，另一方面也會影響生物制品的產量和質量。
2.2平衡鹽溶液
平衡鹽溶液（balanced salt solution，BSS ）簡稱鹽溶液，集緩沖液的緩沖能力、生理鹽水的等滲性以及培養液的營養供應特點于一體，兼具維持滲透壓、緩沖和調節溶液的酸堿度、同時供給細胞生存所必需的能量和無機離子成分的作用。各種BSS的緩沖系統有所不同，其中以Hank’s液和Earle’s液為例，它們主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Earle’s (2.2 g/L)中比在Hank’s (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的pH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hank’s液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Earle’s液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hank’s液就可以了。
 表 3-1 幾種常用的平衡鹽溶液配方（g/L）
一些BSS含有的Ca2+、Mg2+是細胞膜的重要組成成分，同時參與許多重要的細胞功能活動。但它們有使細胞凝集的作用，在配制分散細胞的消化液和特殊用途的細胞洗滌時，宜采用Ca2+、Mg2+含量較低的Dulbecco液或無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液，或者PBS液。
2.3基礎培養基
2.3.1 概述
基礎細胞培養基主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM 、DMEM/F12等。主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。人工合成培養基使用時還需添加一定量的血清使細胞生長和繁殖。
2.3.2 組成及作用
氨基酸：組成蛋白質的基本單位。不同的細胞對氨基酸的需求各異，但幾種必需氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養液提供，如組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等。其余非必需氨基酸，細胞可以自己合成，或通過轉氨作用由其他物質轉化而來。絕大部分細胞對谷氨酰胺有較高的要求，因為谷氨酰胺是作為能源
及碳源物質同時被細胞利用，是是細胞合成核酸和蛋白質必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡，所以各種培養液中都含有較多的谷氨酰胺。細胞所能利用的氨基酸是L型同分異構體，D型氨基酸不能被利用。
維生素：維持細胞生長的一種生物活性物質，對細胞代謝有重大作用。它們在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，沒有它們，酶便沒有活性，代謝活動將無法進行。維生素分為水溶和脂溶兩大類，的培養液中直接采用ATP和輔酶A。
葡萄糖：大部分培養基都以葡萄糖作為能量來源之一。
無機鹽：維持培養基滲透壓平衡，參與細胞的代謝活動。主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+等。Na+是細胞外液中最主要的陽離子，對維持滲透壓的恒定有決定性的作用。K+主要分布在細胞內液，細胞內K+對于激活某些酶是必需的，并在調節細胞內環境的酸堿平衡上也有極重要意義。Ca2+在細胞外液中的作用是將組織內部細胞之間相互粘著，在細胞內參與許多重要的細胞生理活動，如傳導、參與肌肉細胞收縮等。在懸浮培養時，為了減少細胞的聚集和附著，要減少Ca2+的濃度。Mg2+是構成細胞間質的重要成分，對于細胞間相互穩定結合有很重要的意義。磷的化合物對細胞物質代謝和生理功能調控有重要作用。
其他成分：肽、核苷、嘌呤等?？蓭椭毎目寺』囵B及維持某些特殊細胞系的生長。
2.3.3 分類
 2.4 低血清細胞培養基
2.4.1 概述
營養豐富的培養基是維持細胞活性及高密度生長的基礎，營養缺乏容易引起細胞凋亡，新生牛血清中所含大部分營養成分可以通過化學成分明確的營養物質如氨基酸維生素等成分組合取代。低血清培養基營養成分大優于基礎培養基，僅需添加1％～5％新生牛血清，而對細胞生長、增殖、形態、活性和功能沒有影響甚至有所改善。
在國外低血清培養基早已有之，如Gibco等。但是他們的低血清培養基是在基礎培養基中選擇性的加入重組胰島素（recombinant insulin）、人源轉鐵蛋白（human (holo) tran- sferrin）以及牛血清白蛋白等，有些還包含一些生長因子，這些重組蛋白和動物來源成分對生物制品的安全性有很大影響。成本低。
2.4.2 主要用途
 2.4.3 應用案例
采用199(SLM)、MEM(SLM)和DMEM（SLM）低血清培養基分別培養Vero細胞、BHK21細胞和CHO細胞，新生牛血清用量可以從10％降至3％，減少新生牛血清使用批次和批間差的影響，減少生物制品純化損失，減少由于不確定蛋白或者其它血清組分帶來干擾和差異的風險，提高制品安全性。低血清培養基可以在方瓶、3L轉瓶、15L 轉瓶及生物反應器中培養細胞，在疫苗生產中可以達到低血清高密度的培養效果。低血清培養基營養成分優于基礎培養基，易使細胞增殖迅速，代謝旺盛，代謝產物對細胞有不良影響，易產生細胞老化脫落現象。因此需要適當增加換液次數，增加傳代頻率。獲取同樣的細胞量，用低血清培養基將比用傳統培養基縮短近1/3 的時間，可提高生產效率。
采用199(SLM)低血清培養基培養Vero細胞分泌狂犬疫苗病毒，滴度明顯高于采用199 培養基傳統培養獲得的滴度。采MEM(SLM)低血清培養基BHK21細胞，在本實驗情況下12 代內細胞形態和致密度均優于MEM培養基傳統培養情況，因而可以預期其產生的口蹄疫、甲肝等疫苗生產的病毒產量將提高。低血清培養基用于反應器Vero細胞狂犬疫苗的生產，實踐證明效果良好。采DMEM（SLM）低血清培養基添加1％小牛血清在轉瓶中培養CHO細胞生產EOP，可提高收液次數，每次收液表達量明顯提高。
2.5無血清細胞培養基
2.5.1 概述
無血清培養基是用來在無血清條件下生長特殊類型的細胞或進行專門應用的培養基。一般是由基礎培養基和替代血清的補充因子組成。無血清培養基中沒有添加血清，但含有個別蛋白或大量蛋白組分。無血清培養基與無蛋白培養基的區別在于培養基中沒有添加蛋白，但含有一些動物或植物來源成分，如低分子量肽的水解物。還有一種化學限定培養基，培養基中不含有蛋白、水解產物或未知結構的組分，所有成分均有已知的化學結構。
優點：
1） 未知組分少；
2） 培養基中不存在血清中的抗體、補體等成分，對培養細胞影響?。?/div>
3） 雜蛋白含量少，生產的產品后期處理較容易，例如疫苗生產由于人用疫苗需要純化減少雜蛋白，純化過程中成本消耗很大，疫苗的損失也很大；
4） 無血清培養既可以實現細胞的大規模懸浮培養，增加培養液的利用率，可以采用發酵罐培養減少了人力消耗。
缺點：
目前為止不是所有的細胞都能在無血清培養基中培養。無血清培養基的某些組分價格昂貴，導致無血清無法工業推廣的主要原因。
2.5.2 無動物組分無血清細胞培養基的應用
 三、細胞培養基的質量標準和檢測方法 3.1細胞培養基的質量標準  3.2細胞培養基的檢測方法
3.2.1 澄清度
水是細胞培養基的溶劑。細胞培養基中的營養成分只有完全溶解于水才能被細胞吸收攝取，細胞才能生長增殖，因此細胞培養基是否溶解以及培養液是否透明澄清直接影響培養基使用。該項目是通過對水溶解后的細胞培養基的澄清度檢查，判斷細胞培養基的澄清度。 按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅸ B進行。
3.2.2 pH 值
哺乳類動物細胞生長需要合適的酸堿度，pH過高或者過低都會導致細胞死亡。pH值的測定也可以檢查細胞培養基的批間差。清大天一標準規定取規定量供試品，用注射用水（水溫20℃-30℃）溶解至1L，加入規定量碳酸氫鈉到上述溶液中，用與細胞培養基溶液pH值相近的兩點標準緩沖液校準后的酸度計進行測定。按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅵ H進行；加入規定量的碳酸氫鈉（見表4-12）到上述溶液中，按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅵ H進行。
3.2.3 干燥減量的質量分數
細胞培養基具有吸濕性，在空氣中放置水分會很快升高，干燥減量的質量分數表示產品中含濕量。細胞培養基是有菌制劑，其豐富的營養成分有利于微生物生長，控制細胞培養基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持細胞培養基的養分。按中華人民共和國藥典2005 年版二部附錄Ⅷ L 干燥失重測定法進行。
3.2.4 滲透壓
溶劑通過半透膜由低濃度向高濃度溶液擴散的現象稱為滲透，阻止滲透所需施加的壓力，稱為滲透壓。細胞必須生活在等滲環境中，動物細胞借助K＋、Na＋維持滲透平衡。大多數細胞對滲透壓有一定的耐受性。但是培養液滲透壓過高容易使細胞脫水萎縮，培養液滲透壓過低容易使細胞膨脹破裂，因此要控制培養基的滲透壓范圍。按中華人民共和國藥典2005 年版二部附錄Ⅸ G 滲透壓摩爾濃度測定法進行。
3.2.5 細菌內毒素
細菌內毒素是許多病原性細菌所產生的毒素。它的特殊性在于不是細菌或細菌的代謝產物，而是細菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有生物活性的物質。培養基細菌內毒素過高，對生物制品疫苗（如狂犬、乙肝疫苗）、基因工程藥品等注射用的藥品都需要檢查細菌內毒素。 因此本項目的檢驗符合生物制品質量控制要求。常規細胞培養基的細菌內毒素標準定為＜10 EU/ml。稱取本品規定量（見表4-12）的1/100，加入細菌內毒素檢查用水10 mL溶解，吸取該溶液0.1 mL加細菌內毒素檢查用水3.9 mL，混勻即得試樣。按中華人民共和國藥典2005 年版二部附錄Ⅺ E 細菌內毒素檢查法中的凝膠法進行。
3.2.6 微生物限度
細胞培養基不是無菌產品，其中的微生物在一定條件下會吸收細胞培養基中的營養物質滋生繁殖，導致細胞培養基變質失效?？刂萍毎囵B基中細菌和霉菌，是延長細胞培養基有效期的方法之一。清大天一在參考《中華人民共和國藥典》2005版二部附錄第100頁的口服給藥制劑的微生物限度標準，并嚴于該標準，規定細胞培養基產品的細菌數每1g不得超過200個，霉菌數每1g不得超過
50個。
稱取樣品1 g，加入無菌純化水10 mL溶解，混勻即得試樣。按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅺ J 微生物限度檢查法進行，檢查項目為細菌數、霉菌數。檢查法采用平皿法。
3.2.7 細胞生長試驗
這是一個性能特性表述的要求。細胞培養基的功能就是培養哺乳類動物細胞，因此經過細胞培養效果的檢驗是產品質量優劣的直觀表述，這也是很多生物制藥用戶要求的一項指標。目前國內尚無細胞培養和計數的法定方法，可參考《體外培養的原理與技術》中細胞計數法論述的內容給出。按產品說明書配制培養液進行細胞培養，前四天用含10％小牛血清的培養液培養，觀察細胞形
態并計數，檢查細胞培養基是否有促生長的能力。后三天用不含小牛血清的培養液維持培養，觀察細胞形態并計數，檢查細胞培養基中是否有不利細胞生長的毒素。本試驗用細胞為VERO細胞。
四、細胞培養基的使用方法 細胞培養基的種類繁多，細胞培養方式也較多，如何正確地使用培養基及最大程度地保持培養基的營養以維持細胞的生長，對每個培養者都很重要。培養基的使用依不同的培養基種類、培養方式、細胞種類的不同而存在差異。
4.1 細胞培養液的構成
細胞培養液指細胞生長的液體環境，一般指完全培養液，添加了血清、水解乳蛋白、各種添加劑等可以直接使用的培養液。
4.1.1 細胞培養基&血清模式
血清對于在傳統培養基配方中生長和增殖的大多數細胞系來說是需要的，因為大多數單獨的培養基并不能提供細胞生長所需要的全部營養，如MEM培養基，較為常用的量為5％～10％的比例，而特殊的低血清培養基血清量可降至3％左右，細胞的形態和功能不受影響。
4.1.2 細胞培養基&乳歐液模式
化學合成培養基現雖已大規模使用，但在某些培養領域水解乳蛋白仍在使用，以補充培養液中缺乏的氨基酸、小肽物質。較為常用的方式是用漢氏（Hanks’ BSS）或歐式(Earle’s BSS)平衡液溶解水解乳蛋白（一般為5‰濃度），即成乳漢（歐）液，再與化學合成培養基（一般為MEM）按比例混合使用（如1：1）。
4.1.3 細胞培養基&各類添加劑（生長因子等）模式
成分復雜的培養基還含有許多化合物，包括蛋白質、多肽、核苷、檸檬酸循環的中間產物、丙酮酸及脂類等。已發現當培養基中的血清濃度減少時，這些成分都是必需的。既使在使用血清的情況下，這些成分也可幫助細胞的克隆化培養及維持某些特殊細胞系的生長。激素和生長因子在大多數常規培養基的配方中都沒有注明，但在無血清培養基中通常要加入它們，用其來代替血清中的激素能增加多種不同類型細胞的貼瓶率；生長因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF－1和IGF－2及白介素等，生長因子和細胞因子有著廣泛的特異性，一般與激素或其它物質起相互協同或加成作用。另一種常見的添加物就是血清替代物，目前已有許多可完全或部分替代傳統培養液中血清成分的商業產品，其穩定性較好，但批次間仍有差別，產品的成分也不很確定。
4.2細胞培養基配制
4.2.1 干粉培養基原倍液的配制
1）配制過濾除菌的細胞培養基
(1) 閱讀培養基使用說明，確定需要添加何種添加劑（如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等）。
(2) 根據所需將培養基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內殘留培養基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解。
(3) 加入規定量的碳酸氫鈉及所要添加的物質。
(4) 輕微攪拌溶解，加注射用水至規定體積。
(5) 用1 mol / L 氫氧化鈉溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調pH至所需值。
(6) 用0.22 μm濾膜正壓過濾除菌。
(7) 溶液應在2℃－8℃下避光保存。
具體使用方法參照培養基包裝袋上的說明書。
2）配制可高壓滅菌細胞培養基
(1) 根據所需將培養基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內殘留培養基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解。
(2) 在121℃、15psi下滅菌15分鐘。
(3) 待溶液冷卻至室溫，加入無菌0.2 mol / L L－谷氨酰胺溶液規定體積、無菌7.5％（w/v）碳酸氫鈉溶液規定體積，加注射用水（20℃～30℃）至規定體積，混勻。
(4) 如果必要，用1 mol / L 氫氧化鈉溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調pH至所需值。
(5) 溶液應在2℃－8℃下避光保存。
具體使用方法參照培養基包裝袋上的說明書。
4.2.2 注意事項
1） 細胞培養用水一般為三蒸水（經石英蒸餾器蒸餾）或超純水，醫藥生產上一般為注射用水。
2） 建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用，因為包裝一旦打開，組分可能會變質或因受潮而結團。
3） 溶解干粉培養基時先加入終體積90％－95％的培養用水，添加劑加完后再補足。
4） 如需添加的組分較多時，某一組分完全溶解后，再添加另一組分。
5） 待培養基完全溶解后再加入碳酸氫鈉，以免產生沉淀。
6） 所有成分完全溶解后，培養基應立即過濾或高壓除菌，以免產生沉淀或有微生物污染。
7） 在過濾除菌時，一般情況下應調pH比所需值低0.1～0.2個單位，因過濾除菌后，pH值會升高約0.2。
8） 在細胞培養過程中，建議不加或加少量的抗生素，如血清的濃度較低則所加抗生素的量也要相應降低一些。
9） 建議用1 N HCl或1 N NaOH來調節培養基的pH，因為用碳酸氫鈉來調對培養液的滲透壓影響比較大。如下圖所示：
 圖6-1 MEM培養基（SLM，MD611）在pH值相同情況下所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對應的培養液滲透壓
 圖6-2 199培養基（MD502）在pH值相同情況下所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對應的培養液滲透壓
4.3 培養基滅菌 培養基的滅菌方法主要有兩種，高壓除菌及0.22 um微孔濾膜過濾除菌。與過濾相比，高壓滅菌的工作強度小，相對便宜，失敗率低，但易造成營養成分的流失。 4.3.1 高壓滅菌
某些培養基（如MEM）可進行高壓滅菌，例如清大天一的MEM培養基中的MD605、MD609等。其中不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，可在高壓滅菌后加入。另外可高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）可代替L-谷氨酰胺。
為保證高壓滅菌的效果，滅菌設備的驗證很關鍵，可高壓滅菌的培養基在121℃、15psi，15分鐘的條件下完全可達到滅菌效果及營養成分的最小損失，因此不需將滅菌時間延長。
4.3.2 過濾滅菌
大多數培養基采用0.1～0.2 μm孔徑的微孔濾膜進行過濾滅菌，并且已成為培養基除菌的發展方向，它可低限度地減少培養基的營養損失。
4.4 細胞培養液的儲存
細胞培養液的儲存條件一般為2－8℃、密閉、避光保存，但要注意如下幾點：
1） 過濾后的完全培養液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培養液要盡快使用，一般在2－3周內使用完。培養液中的L-谷氨酰胺是不穩定的，不同溫度L－谷氨酰胺的降解見下圖
 圖 6-3 pH 為7.6時不同溫度2mM谷氨酰胺的穩定性
 圖 6-4 室溫下不同pH時10mM谷氨酰胺的穩定性
2） 滅菌后的未加L-谷氨酰胺等添加劑的培養基溶液，一般可在4℃保存6～9個月，也可冷凍保存，用時解凍。
3） 高壓除菌后的培養基應置4℃保存，不能因為其可耐受高溫而忽略儲存溫度。
4） 添加某些生長因子、激素等添加物，可能會改變培養液的儲存條件，比如溫度、時間等方面的要求。
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