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土壤中抗生素抗性基因豐度不斷增加 C.W. Knapp, J. Dolfing, P.A.I Ehlert, et al. 前言 在過去的幾十年里，抗生素抗藥性（AR）引起了越來越多的關注。抗甲氧西林金黃葡萄球菌（MRSA）、抗萬古霉素腸球菌（VRE）等具有傳染性的“超級細菌”的出現正在威脅著世界范圍內的健康服務系統。有趣的是，環境微生物（即腸道系統之外的物種）對抗生素化合物的抗性是一個自然現象，特別是在土壤中更是如此；然而，至今還不清楚超級細菌的傳染性與環境微生物的抗性是什么樣的相互關系。例如，盡管二次大戰以來抗生素和抑菌劑的工業生產顯著增加，但還不清楚自然土壤中的AR背景值是否發生了變化。這可能是因為環境微生物同時暴露于抑菌劑、重金屬以及其他不利環境之中，致病微生物可能會在土壤有機體中為抗性特征提供匯集的場所，這將對公眾健康造成更為廣泛的不利影響。雖然不能明確超級細菌與環境有機體之間的關系，但將現在土壤中與大范圍抗生素工業生產之前土壤中AR的水平（作為研究的初始點）加以對比也是非常有意義，這也是本研究的基礎。 青霉素是最早被廣泛使用的一種抗生素（1928年Alexander Fleming發現），在20世紀40年代早期實現了大批量生產。隨后很快鏈霉素、四環素和其他抗生素也進入了工業生產階段。生產能力的不斷提高以及價格的不斷下降促進了抗生素在醫療領域之外的應用。例如，研究發現低劑量的抗生素能夠促進牲畜的生長，因此常被作為預防藥劑加入到動物飼料中。隨著應用領域的不斷擴大，抑菌劑的生產和使用不斷增加。盡管還無法準確計算抗生素的年使用量及年生產量，但貿易數據顯示，在1990年前抗生素的生產呈現指數增加的趨勢，其中大于50%的抗生素被用于農業生產領域。 抗性生物的發現使得抑菌劑在人類藥物及農業方面的使用更加審慎，但依然能在城市污水、地表水、海洋、沉積物及土壤中檢測出抗生素抗性基因（ARG）。另外，有跡象表明環境中抗性微生物能夠積蓄AR特性，它們可能會通過水平基 因傳遞或其他機制將對抗生物的抗性傳遞給病原體。因此評價抗生素和抑菌劑的使用是否已經改變并持續改變自然中的“背景”抗性水平，判斷環境生物體是否有機會將抗性傳遞給病原體就顯得非常重要了。 幸運的是，最近的研究發現，檔案土壤提取出的DNA為了解歷史微生物群落提供了非常有價值的信息。在這種理念的指導下，我們獲取了荷蘭鄉村5個長期監測點位1940~2008年間的檔案土壤樣品，定量分析了土壤中18種抗性決定子（包括針對超廣譜β-內酰胺酶、四環素、紅微素和糖肽類抗生素的ARG）的豐度。盡管ARG并不一定實現抗性的表達，但它們能夠反映抗性的“潛力”，這也是唯一可用的標記物，可以比較它們在歷史樣品中豐度的差異并研究長期的變化趨勢。本研究采用的檔案土壤在土壤類型、灌溉水和肥料使用歷史、重金屬暴露等方面具有差異，這也為研究ARG水平的影響因素提供了便利條件。最后測定了微生物16S-rRNA基因水平，用來比較采集時土壤中的微生物水平，評價土壤儲存條件對DNA的影響，利用每個土壤中的微生物總量將ARG水平進行標準化，利于盡心對比分析。 材料與方法 采用的檔案土壤 土壤樣品來源荷蘭瓦格寧根大學和研究中心的TAGA土壤檔案系統。TAGA系統包括1879年以來多項研究所用的土壤，本研究采用土壤基本情況見表1（表略），其地理位置見圖1（圖略）。需要特別強調的是土壤采集的目的并不是用于該研究，采樣點位有用的背景信息較少，較為久遠的土壤更少如此。因此，我們必須限定本研究的結論，只能得出一個總體趨勢而非詳細的特征信息。 例如，點位A位于Wieringerwerf，在1960年至1986年間的一項關于濱海粉質壤土再利用的農業研究中采集了土壤樣品。該點位于1930年從Waddenzee收回，在1940年左右開始用于農業生產，1955年開始燕麥、小麥和馬鈴薯輪作，為了研究無機肥料對作物輪作的影響研究人員采集了土壤樣品。該點位主要使用礦物肥料，包括氮磷鉀肥，在該研究期間，燕麥種植時也間歇性地施用了有機肥，施用量約為135t/hm2，但是有機肥添加的具體時間沒有詳細記錄。點位B位于荷蘭東部的Heino，土壤為腐殖砂土（1950~1971年），施用了有機肥及無機肥料，試驗期間的有機肥使用量約為1 250t/hm2。由于較大的有機肥使用量，因此我們將該點位假定為有較高ARG水平的“正參照”，但是研究結果并非如此。 點位C位于Wieringerwerf的Slootdorp村莊，土壤類型為濱海粉質壤土，為了評價鉀肥的功效進行了田間試驗，在1940~1975年間采集了表層土壤樣品（0~25 cm）。試驗期間鉀肥的施用量約為80t/hm2，時間約為20世紀60年代，準確時間未記錄。點位D的土壤主要是輕度濱海粘土，與Wieringerwerf的土壤（點位A和C）較為類似，灌溉水來自于艾塞爾湖的入口。點位E主要為砂土（76.8%的砂子，16~2 000μm），地下水位多變（冬季小于1m，夏季大于1.5m）。點位D和E主要研究磷礦粉作為磷肥的可行性，沒有添加有機肥，都具有溝渠灌溉系統，但點位E的灌溉水來自VAM kanaal和Oude Diep，而非艾塞爾湖。 樣品處理及DNA提取 土壤在30~40℃下風干，研磨，檔案室內室溫下保存。土壤DNA提取采用UltraClean土壤DNA提取試劑盒，在廠家操作手冊的基礎上進行了一些修改。稱量150~300mg的土壤（干重）放入事先準備好的裝有緩沖液和提取劑的離心管中。緩沖液預冷至4℃，樣品培養30min使其再水化。在Hybaid Ribolyzer中進行細胞溶解，樣品在70℃下培養10min以幫助革蘭氏陽性菌的溶解，在ribolyzer中再次震蕩。根據廠家操作手冊對樣品進行進一步的純化。DNA提取液在-20℃下短暫保存（若長期保持則要在-80℃下）。前期研究表明，DNA干燥和保存對原核和真核微生物的可檢測部分沒有明顯的影響，本研究再次驗證了這一點。 qPCR方法 青霉素、四環素、大環內酯（如紅微素）和萬古霉素的使用歷史已達80a之久，不同的抗生素使用年限也有差異。之所以選擇這些抗生素和抑菌劑的抗性決定子并加以對比，是因為它們代表不同的藥物類型、靶位以及作用方式，并在不同的年代曾應用于農業和醫藥領域。使用實時qPCR進行18種ARG和16S rRNA基因豐度的定量測定。盡管不可能對所有的可能基因加以定量化，但選擇的基因代表了不同的藥物種類，能夠反映不同的抗性機理。為目標抗性基因選擇或指定合適的引物和探針，這些信息總結在表2（表略）中。參照已發表的方法進行四環素抗性決定子[tet(B)、tet(L)、tet(M)、tet(O)、tet(Q)和tet(W)]的分析，紅微素抗性甲基化酶決定子[erm(B)、erm(C)、erm(E)、erm(F)]，以及vanA、vanB、mecA、ampC、blaTEM-1、blaCTX-M、blaSHV-1和blaOXA-1的測定均參照已發表的方法。 探針和引物設計 16S rRNA基因分析使用了普適性真細菌探針和引物，它們也常用于qPCR反應中測定微生物總量。根據前期建立的方法篩選tet決定子、ampC（氮芐青霉素抗性，group-1, class-C ESBL）、vanA（萬古霉素抗性基因）以及blaCTX-M（group 2，class D ESBL）適合的引物和探針，最終使用了TaqMan探針。第2個萬古霉素抗性基因（vanB）參照Palladino等的方法，并加以修改。對NCBI GenBank網站上的BLASTn檢索并以細微修改以增加分析的普適性；用VanB-FL探針序列替代原有的正義引物，將VanB-640結合到TaqMan探針之中，而反義引物（VanBR）則保持不變。甲氧西林抗體（mecA）分析包括Rieschl等發現的正義引物、TaqMan以及Tan等發現的反義引物。 本研究依然采用了文獻中發表的正義和反義引物，但對Erm決定子進行了修改使其適應qPCR的需要，降低擴增子的長度（通常小于200bp）。然而，根據Primer3軟件及聯合GenBank序列的結果我們還設計了其他的引物。利用BLASTn軟件測試引物的特異性，隨后在不同的退火溫度下通過試驗檢測所有引物的反應。 在文獻發表的2種通用引物blaTEM-F和5’-GGAATAAGGGCGACA的基礎上構造出了blaTEM，將之作為反義引物。在blaTEM-1和blaTEM-2序列及Primer3軟件的基礎上進行引物篩選。根據最近的BLASTn檢索結果，對選擇的blaTEM引物對的通用性加以測定，發現包括1~3、6、10、12、21、22、26、54、60、67、70-72、77~84、89、104~107、109、128~129、131、138、144、150~152、158、162和163等TEM-變量。blaSHV（blaSHV-F和blaSHV-R）的引物利用相類似的方法加以構建；對其通用性加以檢測，它主要包括1~2、5、7、11~14、18、25~26、28、30~31、36~37、42、55~56、59~66、69~71、73~83、89、93~96和104。blaOXA-1的目標物為blaOXA的第1簇；正義引物是Moland發現的反義引物的反向互補序列以及未經改變過的反義引物。使用的GenBank序列包括AY008291、J02967、EF415651、EU117233和AF227505，其分析的標的物是blaOXA-4和blaOXA-30。 qPCR方法 反應條件。DNA模板（2μL）、合適的引物、TaqMan探針與iQ supermix PCR試劑、分子級水混合起來，體積為25μL。在配有iQ熒光檢測器、2.3版本軟件的BioRad iCycler中開始反應。溫度循環方式為95℃（10min）、94℃循環40~45次（20s），隨后為退火及延伸條件（見表2，表略）。所有樣品重復2次，任何樣品出現較大的偏差（較高的分析差異）都將重新分析。平行樣品的差異在±0.3（對數比例）以內。很多情況下，常檢測TaqMan探針、雙重標記的具有5’-熒光團和3’-淬火團的寡核苷酸。除此之外，SYBR-green I、非特異性熒光染料也可用于檢測，隨之繪制溫度溶化曲線來確保反應質量（50~95℃，ΔT =0.1℃/s）。 所有反應都需要用梯度稀釋的已知量的質粒-DNA標準品（用革蘭氏陽性菌制作）加以檢驗。向樣品中添加已知量的模板，對比該混合樣品與對照樣品在濃度臨界值（CT）上的差異（通常小于1個循環的差異），判斷樣品中是否有某種抑制物質。用分子級水按照1:100（點位A和B）或1:1 000（點位C-E）將其稀釋能夠很好地減弱抑制物質的影響。另外，為了檢測是否有抑制物質，可以對比某些樣品（指的是那些具有較高DNA濃度的樣品）梯度稀釋溶液和質粒對照樣品的PCR效率（通常處于75%~110%）。所有標準曲線的相關系數都高于0.990，對數基因豐度值也處于標準曲線的線性范圍之內。 數據分析 ARG豐度需要對16S rRNA基因豐度進行標準化，以減弱不同提取過程和分析效率引起的分析偏差，縮小背景微生物豐度的差異。這就在每個采樣點位生成了一系列時間序列的相對ARG值。利用這些數據結合不同的回歸模型（如線性、指數或冪函數），可以評價出各種基因隨著時間的變化趨勢，殘差和決定系數（R2）可以用于選擇最佳模型。在時間序列中指數函數的擬合效果最好。 在長期趨勢分析中（即從1940~2008年），采用了幾種不同的方法來整合不同的時間序列，最后得出結論，當所有時間序列都有數據時，可以使用最小偏差法將所有“ARG與16S rRNA的比值”整合于某一個時間窗（即20世紀70年代中期）的試驗數據，因此每一種ARG在1970~1979年的平均值就被賦予值1.0，而1970~1979年時間段之前和之后的單位ARG水平則通過比例變化加以計算。這個整合過程將不同時間段的監測結果統一起來，消除了每個采樣點位在土壤類型或其他條件上的不同所導致的背景ARG和16S rRNA基因水平的差異。整合后的數值用于測定某種基因的長期變化趨勢，以及某種抗生素類別下所有檢測基因的總體趨勢。后面一個步驟是非常有價值的，因為它能夠將不同時間段的數據集中起來，增加不同趨勢預測的統計學意義。 結果和討論 選用了5個土壤系列進行測試，是因為它們從二戰結束至今均經歷了抗生素的大批量生產，在這段時期內，20世紀70年代末荷蘭改進了對廢物處理的程序，并且過去的10年非治療性抗生素在農業領域的使用越來越受限制。圖1和表1概述了這些土壤的位置和類型、水資源、有機肥的施用水平以及樣品采集后所保存的時間，這些特征在不同的土壤系列中略有不同。本研究也考慮了其它點位檔案土壤，它們可能能夠代表更長的時間窗口，然而，我們最后選擇僅關注TAGA的檔案土壤，因為它們的處理和儲存方法比較明確且均一。 在所有土壤樣品中，每克土壤（干重）中的16S-rRNA基因含量處于108~1 010，上層土壤更是如此。為了測試土壤樣品退化的可能性，對每個系列的土壤中16S-rRNA含量值的對數隨時間的變化進行了線性回歸分析。然而，在檔案土壤樣品中并未觀察到每克干土中16S-rRNA含量水平隨時間有顯著的變化（r2<0.48，p>0.13）。因此，雖然其他研究指出檔案土壤儲存過程中可能伴隨這土壤的污染或DNA降解，本研究并未發現這種現象。 計算了5個采樣點位每種抗生素的單一基因及所有基因的ARG相對于16S-rRNA的相對豐度（標準化）（包括每個采樣點位中每個土壤樣品的絕對及相對基因豐度）。在ARG隨時間變化的首次評價中，標準化的某種ARG隨時間的變化用指數模型模擬，來測定每一點位基因的總體變化趨勢。盡管只有31%的速率系數具有統計意義上的顯著性（p<0.10），但有78%（64中的50個）的標準化單一ARG隨著時間的推移逐漸增加。然而，有4個點位的標準化單一ARG水平，即點位C的所有系數為正，而點位A、E和D都具有3個以下的負系數。事實上，只有點位B的標準化相對ARG水平沒有明顯增加。此外，測定的主要類別的抗生素抗性基因的含量都隨著時間的推移而逐漸增加，其中四環素抗性基因含量的增加更加頻繁地表現出統計意義上的顯著。 雖然這些結果提供了一些信息，并大致表明ARG水平隨時間增加而增加，但是它們并沒有描述出ARG含量的長期變化趨勢，因為每一個土壤系列代表了不同的時間段。因此，這些標準化的數值被整合為1970~1979年測定數值的平均值，5個點位的時間序列都包括這個時間段。這一方法為1940~2008年每種ARG及ARG種類提供了一個綜合的時間序列，雖然不同點位具有不同的背景土壤和其它條件，這種方法允許對不同點位的長期變化趨勢加以對比。對整合數據（概括了所有點位的ARG檢測數據，包括點位B）的趨勢加以總結，結果顯示從1940年以來ARG豐度呈現出顯著增加的趨勢。這些趨勢適用于所有類別的被測抗生素，并且這與每塊點位標準化基因的變化趨勢，以及基于整合ARG數據計算出的單一基因的長期變化趨勢都較為吻合。 該結果進一步表明，包含ARG的土著細菌的相對比例隨時間變化而顯著增加，與1970~1979年時的水平相比，2008升高了2~15倍。值得注意的是其顯示出比點位標準化基因變化趨勢（p<0.05）更高的統計顯著水平，這可能是因為速率系數是在更大的數據基礎之上進行估算的。在單一ARG中，標準化的和整合的ARG豐度增加速率最快的是四環素[尤其是tet(Q)、tet(O)和tet(M)]以及β-內酰胺酶blaTEM-1。有趣的是，我們發現了CTX-M系列中超廣譜β-內酰胺酶的升高（即blaCTX-M-1，見表S3），這比臨床中遇到blaCTX-M-1問題的時間還要早，這表明抗性的決定子可能來源于土壤，這與我們前期的推測是一致的。 大部分被測ARG的豐度隨時間變化而增加，而不同的基因和點位間依然存在著差異，這對了解某些特定點位中影響抗性基因長期保持的主要因子具有十分重要的參考價值。相應地，我們評價了多種“本地的”因素，包括土壤重金屬濃度、土壤的吸附作用和排水特征、有機肥或其它化肥的施用水平、不同的灌溉方法，抑或是其他沒有考慮到的因素。例如，測定了土壤重金屬的含量，以確定在特定土壤中抗生素抗性的提高是否是由于已經存在的重金屬導致的。然而長達68年的樣品記錄顯示，土壤重金屬濃度并未顯著增加。實際顯示在1940年到20世紀60年代末之間在金屬濃度增加的同時ARG濃度也在增加，但此后金屬濃度下降而綜合ARG最大的趨勢最大。 由于歷史資料有限，我們的研究僅僅是定性分析，但是土壤類型、灌溉水源和類型、以及肥料使用等方面的差異在一定程度上可以暗示出影響ARG時空變化的主要因素。土壤樣品采集時的目的并非開展本研究，點位上使用的其它化學物質、肥料應用的模式、灌溉水的水質和用量等重要的數據，或沒有記錄或已不可知。無論如何，做一些推論是可以的。例如，如果將1986年以前3個點位樣品的ARG濃度加以比較，點位A和點位C的相對ARG濃度大致呈現增加的趨勢，而點位B則沒有。盡管這3塊點位均接受灌溉水和肥料，但只有點位B的土壤是排水性能較好的沙質土，灌溉水也沒有受到污染。作為背景參照點，點位A和點位C長期受到鹽水入侵的侵擾，因此它們一直需要來自艾塞爾湖的淡水進行灌溉，而在20世紀80年代前艾塞爾湖水就受到生活垃圾和其它垃圾的嚴重污染。相反，盡管肥料施用記錄不系統，但點位C有機肥的施用量比點位A和點位B高出近10倍。因此，基因的數據顯示，很明顯的一條結論是灌溉水水質（灌溉水和背景鹽水）和土壤排水性能可能比有機肥的施用更加重要，這與我們最初關于有機肥作用的假設相反。大量的證據表明，有機肥的施用會向土壤中引入ARG；然而在研究長期影響時，灌溉水水質和排水似乎顯得更加重要，這需要進一步的研究加以確認。 環境保護正在逐漸改善，那么為什么ARG水平仍然在升高？在我們的研究中，荷蘭的某些特定的行為可能是這個問題的答案，盡管在世界上這樣的地域性活動并不罕見。例如，盡管一再強調在農業生產中盡量不要使用抗生素，但1997年以來荷蘭對抗生素的使用呈現出驚人的增長速度。在歐洲較為嚴格的制度的控制之下，荷蘭出現這種現象的真正原因仍處在爭論之中；然而，這種增長與點位D和點位E土壤中ARG水平的升高如出一轍，四環素更是如此。不論原因如何，近年來ARG水平的升高只不過是土壤中抗性基因明顯增高這一現象的延續。回顧過去可以發現，不同的因素在不同的歷史時期會顯得格外重要或沒那么重要，包括重金屬污染、污染地表水的灌溉、海水入侵以及農業中抗生素使用量的增加等。總體上而言，我們的研究表明單一的修復方法不可能成功地減弱抗生素抗性增加這一趨勢，這就需要能夠同時針對多種原因的全面戰略，在抗生素大量生產仍在繼續的情況下更是如此。 本研究展示出了荷蘭土壤中抗性逐漸增加這一趨勢，研究結果也意味著在世界范圍內開展更多的類似的研究。例如，本研究結果表明，我們可能遇到對抑菌劑療法具有抗性的生物體的幾率將日漸增高。隨著遺傳物質的水平交換以及細菌宿主多樣化的增加，環境中的或共生生物體中的每一種潛在的外源抗性基因都會使病原菌獲得抗性的機會大大增加。此外，由于土壤可以作為對土著微生物有益決定子的儲蓄場所，即使將來抑菌劑的使用越來越謹慎，過去某個時段的抗生素和抑菌劑的暴露都可能對抗性基因庫有著無法磨滅的影響，當然還需要進一步的驗證。總體而言，本研究的數據表明目前還沒有完全篩選出促進抗生素抗藥性升高的環境因子，這就需要對抗生素抗藥性、環境及人為因素的相互關聯進行進一步的研究。國家醫事委員會的報告“通往最小抗性之路”中說，“現在有一種不安的感覺，微生物種類越來越多，而治療的方法的卻越來越少”，本研究的結果也顯示，土壤微生物逐漸增強的抗性可能會成為一個新的難題，它將對人類與全球抗生素抗藥性間戰爭形成新的沖擊。 張長波 譯自Evidence of Increasing Antibiotic Resistance Gene Abundances in Archived Soils since 1940. 《Environmental Science & Technology》, 2010, January, 15: 580~587.
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