張寧，王鳳山
(山東大學(xué)藥學(xué)院生化與生物技術(shù)藥物研究所，山東濟南250012
《中國海洋藥物》試驗方案 51protocol.com雜志2004年第2期(總第98期)
摘要:DNA的提取是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)，提取的DNA的純度及結(jié)構(gòu)完整性是進(jìn)行基因工程各項研究所必需的條件。近年來一些新的或改進(jìn)的DNA提取純化方法不斷出現(xiàn)，本文對從陸生動物、植物、微生物以及海洋生物提取DNA的方法進(jìn)行綜述。
關(guān)鍵詞:DNA;提取;動物;植物;微生物;海洋生物
Advances of DNA extraction methods
ZHANG Ning，WANG Feng-shan
(Institute o f Biochemic and Biotechnological Drugs，School of Pharmacy，Shandong University,
Jinan 250012，China)
Abstract:DNA extraction is a basic technology of molecular biology. The purity and the integrality of DNA structure are necessary for different experiments of gene engineering. In recent years there have been some new or improved DNA extraction methods appeared. The methods of DNA extraction from animals，plants，microorganisms and marine organisms were summarized in this article.
Keywords:DNA;ex traction;an imals;plants;microorganisms;marineo rganisms
自 20 世 紀(jì)50年代Watson和Crick提出DNA雙螺旋模型以來，分子生物學(xué)在廣度和深度上都獲得空前的發(fā)展。DNA作為分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，在生物領(lǐng)域尤其是遺傳學(xué)方面的研究日漸深人，在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生的基因工程技術(shù)已在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。研究和應(yīng)用DNA的基礎(chǔ)是提取純化結(jié)構(gòu)完整的DNA，為此針對不同來源的DNA建立了不同的提取純化方法。本文對從陸生動物、植物、微生物以及海洋生物來源的DNA的傳統(tǒng)提取方法及近年來諸多的改良方法進(jìn)行綜述。
1.動物來源的DNA的提取
1. 1經(jīng)典提取方法
酚抽提法 、異丙醇沉淀法以及甲酞胺裂解法是提取DNA最為經(jīng)典的方法，目前很多方法的改進(jìn)都是在這些方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，這三種方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉(SDS)消化破碎細(xì)胞。在前兩種方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白質(zhì)，再分別用乙醇或異丙醇沉淀DNA。甲酞胺法是利用高濃度的甲酞胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，然后利用透析來處理DNA樣品。這些經(jīng)典方法獲得的DNA純度很高，能夠滿足各種試驗的要求，但操作繁瑣，用時長，且所用試劑具有一定的毒性。
1.2 玻璃棒纏繞法
該 法 用 鹽酸肌裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解物小心鋪在離心管中的乙醇上，用一個帶鉤的或前端為U形的玻璃棒在這兩層液體的交界面慢慢攪動，沉淀出的膠狀DNA纏繞在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA經(jīng)多次乙醇浸泡并于室溫下蒸干乙醇，由膠狀逐漸回縮，然后浸人TE中過夜，使其重新吸水膨脹進(jìn)而和玻璃棒分離。這種方法對操作技術(shù)要求較高，但簡單快速。
1.3 血細(xì)胞DNA的快速提取法
采用 非 離 子變性劑NP40(乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞核，然后用酚/氯仿抽提DNA。這樣從血液中分離獲得的DNA純度高，能夠滿足各種臨床檢驗和實驗的需要。也可采用NP40和Tween -20同時作用破碎細(xì)胞膜，以避免SDS對以后步驟的負(fù)面作用。 Ba sun i等 [‘〕采用了4種常用的從血液中提取DNA的方法:High Pure Viral Nucleic 試劑盒法、QlAamp試劑盒法、Tri- PureTM試劑分離提取法以及經(jīng)典酚抽提法，對通常作拋棄處理的血凝塊進(jìn)行人DNA 及病毒DNA的抽提，發(fā)現(xiàn)前兩種方法可以迅速高效獲得目的DNA，從而建立了由血凝塊中提取DNA的方法，擴大了臨床檢驗樣本的來源。
1. 4 玻璃顆粒吸附法
在該 法 中首先利用含異硫氰酸肌的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，然后加人含有能夠與DNA 結(jié)合的玻璃顆粒的緩沖液，經(jīng)沉淀收集結(jié)合染色體DNA的玻璃顆粒，利用洗脫液進(jìn)行洗脫獲得DNA。不僅玻璃顆?？梢耘cDNA 進(jìn)行結(jié)合，一定大小的硅膠顆粒也可以與 DNA進(jìn)行結(jié)合，據(jù)此，不少實驗工作者實踐了很多利用顆粒結(jié)合DNA 的提取方法。 Pichler等[2〕在從抹香鯨(Physeter macrocephalus) 牙齒及骨骼中抽提DNA時采用了一種以二氧化硅為吸附介質(zhì)的方法，從抹香鯨標(biāo)本骨骼組織中鉆取的少量粉末中獲得了足夠用于分析的DNA產(chǎn)物，此方法擴大了對稀有哺乳動物DNA研究的取材范圍。 Caldarelli-stefano等[3〕在從福爾馬林固定、石蠟包埋的人體組織標(biāo)本中提取DNA時利用小磁珠作為結(jié)合核，也獲得了理想的純化 DNA。很多試劑公司也依此設(shè)計生產(chǎn)了許多顆粒提取試劑盒，Pint。等[4]就探討了采用 Gibc。公司的GlassMAX系統(tǒng)，對福爾馬林固定的組織進(jìn)行DNA提取的具體操作方法，目前這些試劑盒在臨床上廣為應(yīng)用，省時省力。
1.5 三乙醇胺月桂基硫酸鹽(TLS)法
由于 常 規(guī) 方法中使用的蛋白酶K的水解條件不好掌握，采用TLS來提取組織、細(xì)胞以及外周血DNA可以克服這一弊端。 TLS是一種較強的表面活性劑，將其直接作用于細(xì)胞或組織勻漿，可迅速溶解細(xì)胞膜、核膜，而且蛋白質(zhì)與其結(jié)合后即失去對DNA 的結(jié)合，進(jìn)一步的純化可采用常規(guī)方法。
1. 6 臨床病理標(biāo)本的DNA提取方法
由于 PC R技術(shù)不僅可用于基因分離、核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控研究、基因病的診斷及腫瘤發(fā)生機理的探討等。近年來，PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病理學(xué)研究，尤其對福爾馬林固定石蠟包埋病理標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)的研究更成為關(guān)注的焦點。對于從這些病理標(biāo)本中提取 DNA的方法研究也很多。一般采用酚/氯仿抽提法，該法雖然效率較高，但費時費力，而且其操作中要求多次離心，增加了樣品污染的可能性。近年來很多高效靈敏的方法在實踐中得以采用，這些方法通常采用加熱或微波法〔s〕去除包埋的石蠟，使用Sephadex G- 5。柱色譜或鹽析法[s7等去除蛋白質(zhì)。高文濤[71等在研究福爾馬林固定石蠟包埋組織 DNA提取方法對PCR的影響時，發(fā)現(xiàn)在組織切片中加人鰲合樹脂(Chelating Resin，亞氨基二乙酸)提取獲得的DNA可取得較好的PCR擴增結(jié)果。Coombs等〔s〕則采用熱循環(huán)方法，將標(biāo)本上的蠟融人樣品溶液，在酶的作用下進(jìn)行裂解，然后用Chelex-100進(jìn)行吸附，離心去蠟，這種方法安全、簡便、有效、經(jīng)濟。
1.7 鹽析法
該 法用 飽 和氯化鈉代替有機溶劑去除蛋白質(zhì)，所獲得的DNA質(zhì)量可以滿足PCR模板的要求，但產(chǎn)率相對較低，純度較差。譚建明等[9]對上述鹽析法進(jìn)行了改進(jìn)，即將處理過的樣本加人SDS和蛋白酶K后，在56'C 消化1h，然后用飽和氯化鈉沉淀蛋白質(zhì)，并經(jīng)離心除去，上清直接用乙醇沉淀DNA。該法簡化了DNA的抽提步驟，可用于人體各種樣本DNA的提取，所獲DNA的純度可以滿足各種檢測的需要。
2 植物來源的DNA提取
利用 基 因工程手段對植物進(jìn)行定向改造，已成為當(dāng)今植物育種學(xué)發(fā)展的一個新領(lǐng)域，植物基因工程操作離不開植物基因組總 DNA的制備，不同植物的核酸結(jié)合蛋白的情況各不相同，因而要采取不同的提取方法[10]。由于植物中次生代謝產(chǎn)物― 多酚類化合物可介導(dǎo)DNA降解，而多糖的污染也是影響植物DNA純度最常見的問題，這些多糖能抑制限制酶、連接酶及DNA聚合酶等酶類的生物活性。因此要從富含多酚和多糖的植物組織中分離獲得高質(zhì)量的基因組 DNA也并非易事[11l。目前采用的方法有以下幾種。
2.1 十六烷基三乙基澳化按(CTAB)法
CT AB 是 一種陽離子去污劑，它能與核酸形成復(fù)合物，這些復(fù)合物在低鹽溶液中會因溶解度的降低而沉淀，而在高鹽溶液中可解離，從而使DNA和多糖分開，再用乙醇沉淀DNA 而除去CTAB。在該法中使用的聚維酮 (PVP)與多酚結(jié)合形成復(fù)合物，從而可有效避免多酚類化合物介導(dǎo)的DNA降解[121。王卓偉等[13〕在對桑葉DNA提取方法研究過程中發(fā)現(xiàn)PVI〕還能有效地去除多糖。羅志勇等[14〕在研究中對這種方法進(jìn)行了幾點改進(jìn): ①提高CTAB的濃度;②對于含多酚類較多的植物，增加CTAB提取緩沖液中琉基乙醇的含量，同時加人PVP使其與多酚類物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物;③增加低鹽沉淀緩沖液的量;④增加高鹽溶液中鹽的濃度。用改進(jìn)的方法從人參、西洋參、三七等藥用植物中分離獲得了高純度的DNA, Porebski等[1s]在沉淀粗提 DNA時，將提取緩沖液中氯化鈉的濃度提高至2.5m o卜L-’以使DNA在高鹽緩沖條件下優(yōu)先沉淀，可更有效地除去多糖。Stein等[16] 對傳統(tǒng)的CTAB法進(jìn)行了優(yōu)化，創(chuàng)建了一種從新鮮草本植物樣本中提取DNA的方法。首先在特制的有96個孔的托盤上種植植物樣本，并依照不同樣本在托盤中的位置進(jìn)行編號，然后取適量植物葉子分裝在充滿提取液的塑料袋中，除去袋中的空氣并封口，再用特制的手工勻化器將各袋中的樣本混勻，56`C孵育 1h后將袋中的液體取出進(jìn)行離心以及DNA 的沉淀。Xin等〔17〕則采用簡易的96孔托盤作為提取時的容器，將多種植物樣本經(jīng)研磨處理后分別放在不同的孔中進(jìn)行提取，在一天內(nèi)由一人就可完成上千個樣本的DNA提取，為高通量植物基因分析及篩選提供了極大的便利。
2.2 SDS法
為 了避 免 CTAB法試驗步驟多、操作繁瑣的不足之處，近年來又提出了利用SDSTris- Cl-- EDTA等直接裂解細(xì)胞使其釋放出DNA的方法[18]。在該法后續(xù)的DNA純化過程中通常采用酚/氯仿處理，但對于植物 DNA純化不是一個很好的選擇，因為酚的使用可降低DNA的提取效率和純度。王景雪等[19〕在用該法提取DNA的過程中采用較大的離心力和較長的離心時間，然后用氯仿一異戊醇代替酚來去除變性蛋白質(zhì)，從而克服了由于酚的摻人及殘留對以后酶切帶來的困難。楊婉身等[201用琉基乙醇代替SDS，對大豆DNA分離提取能夠更有效地去除蛋白質(zhì)，而且可以有效防止褐變，獲得天然雙鏈高分子量的DNA產(chǎn)物，并且減少了SDS對 PCR、隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)等操作的影響。王得元等[z1〕在對辣椒DNA進(jìn)行提取時為了提高DNA的產(chǎn)率將待提取的植物材料首先在液氮中研磨成粉末，并且針對辣椒葉子中多酚類物質(zhì)極少的特點將其中的加人PVP的步驟省去，消除了PVP對以后操作的影響.
2.3 氯化千法
李思 光 等 (22〕在對稱猴桃的基因組DNA 提取過程中選用了氯化節(jié)法，與其他方法相比該法的得率較高，其原因可能是氯化節(jié)不僅可與植物細(xì)胞壁上的多糖經(jīng)基反應(yīng)生成醚，而且與細(xì)胞液中多糖物質(zhì)的All基反應(yīng)，起到破壞糖鏈的作用，利于DNA的釋放和提純。
2.4 高鹽低pH法
該 法 中 所用的提純試劑僅為無機鹽和異丙醇。通常采用的無機鹽為醋酸鉀，低pH的醋酸鉀是有效的蛋白質(zhì)沉淀劑。與一般氯仿一異丙醇反復(fù)抽提去除蛋白質(zhì)的操作相比該法操作更方便省時，所需樣品量少，適用于
瀕危植物DNA的提取。
2.5 果膠酶法
Ste ve n等 [2s采用果膠酶對植物細(xì)胞破碎后的抽提混合物進(jìn)行消化處理使與DNA共沉淀的膠狀物質(zhì)分解成小的片段，從而無法與DNA一起沉淀下來，降低了DNA的純化難度，提高純化效率。
3 微生物來源DNA的提取
常規(guī) 的微 生物DNA提取多是根據(jù)某種微生物的具體特點選擇合適的方法。在實際的科學(xué)研究過程中，很多科學(xué)工作者通過實踐總結(jié)出許多快速實用的提取方法，現(xiàn)擇其中比較典型的加以總結(jié)。
3.1 細(xì)菌質(zhì)粒的提取方法
質(zhì)粒是獨立于細(xì)菌染色體DNA之外的環(huán)狀DNA，它能攜帶外源基因進(jìn)人細(xì)菌進(jìn)行擴增，或表達(dá)外源基因，是基因工程中常用的載體，在DNA重組技術(shù)、DNA測序、轉(zhuǎn)基因等方面具有廣泛的應(yīng)用。對于細(xì)菌質(zhì)粒的提
取比較經(jīng)典的方法有:堿裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Triton-溶菌酶裂解法等。這些方法的選擇取決于質(zhì)粒的大小、細(xì)菌菌株的性質(zhì)等。Keunosky等GE_發(fā)展了一種以 Zn'+誘導(dǎo)DNA沉淀的方法，在該法中利用一定濃度的ZnCl:溶液使一定體積的細(xì)菌菌液質(zhì)粒DNA大量沉淀，無需多次離心，大大簡化了抽提的步驟。
近年 來 ，一些生物技術(shù)公司，比如Promega公司及Qiagen公司等紛紛推出質(zhì)粒抽提試劑盒，這些試劑盒多運用樹脂材料或硅膠來特異性的吸附質(zhì)粒DNA，提取過程用時少，效率高。
3.2 真菌DNA提取方法
對 真菌 DNA的提取關(guān)鍵是破碎細(xì)胞，通常采取酶解破壁法或以液氮冷凍處理增加細(xì)胞壁脆性的物理破壁法。在這兩種方法中酶解破壁法較為簡單，易于操作和控制，而物理破壁法在處理過程中容易造成細(xì)胞核的大量破損。在提取獲得核酸一蛋白質(zhì)復(fù)合物后，對其中蛋白質(zhì)的沉淀也多采用傳統(tǒng)的氯仿一異戊醇沉淀法或高鹽沉淀法。韓利剛等C25用CTA13法直接從絲狀真菌的新鮮菌絲中提取DNA，并將所提取的DNA進(jìn)行 RAPD，得到了較清晰的擴增圖譜。Loeffler 等[Z6為滿足快速靈敏準(zhǔn)確的臨床檢驗的需要，利用MagNA Pure LC系統(tǒng)建立了一種實用的快速提取方法，該法自動化程度高，避免了可能的交叉污染。Manian等[z7〕在對真菌進(jìn)行DNA抽提時采用幾個循環(huán)的快速制冷、煮沸以破碎真菌細(xì)胞壁，并通過Qiagen 公司的QIAquick DNA純化柱，迅速從極微量的真菌中獲得高純度的DNA大分子。
3.3 結(jié)核桿菌DNA的提取方法
利用 PC R微孔板雜交技術(shù)檢測臨床標(biāo)本中結(jié)核桿菌DNA是診斷結(jié)核桿菌感染的一種快速靈敏和特異的方法。從不同的臨床標(biāo)本中獲得DNA是檢測準(zhǔn)確和成功的關(guān)鍵。而不同來源的結(jié)核桿菌又分別受到不同來源材料的影響，所以提取方法各不相同。同時由于結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁比較厚不易破碎，一般的微波法、異硫氰酸肌法、凍融法等難以破壞結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁。通常采取的方法有:經(jīng)典酶一酚一氯仿法，堿一SDS裂解法，堿裂解煮沸法，超聲裂解法，Chelex-100 法，玻璃粉一硅吸附法等。楊正林等[28〕通過對以上幾種方法的比較發(fā)現(xiàn)玻璃粉一硅吸附法操作簡單，假陽性低，適合臨床檢測使用。
3.4 土壤微生物總DNA的提取方法
土壤 中 細(xì) 菌的含量豐富，種類齊全，從中提取細(xì)菌DNA可用于檢測不可培養(yǎng)的細(xì)菌，跟蹤某些目標(biāo)菌或重組基因在自然環(huán)境中的行為，也可用來解釋土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)中的基因的多樣性及其隨環(huán)境的變化。從土壤中提取和純化DNA是最關(guān)鍵的技術(shù)之一。 Courtoi:等[29]對比了在土壤中直接裂解微生物體、然后提取DNA和先將微生物菌體通過梯度離心與土壤顆粒分開再進(jìn)行提取的方法，利用PCR技術(shù)以及雜交技術(shù)檢測不同方法獲得DNA的種類和純度，發(fā)現(xiàn)前一種方法具有更高的效率，能夠提取獲得較多微生物物種的 DNA。張瑞福等[30]采用SDS高鹽提取法和透析袋回收法對9種不同來源的土壤進(jìn)行微生物DNA的提取，與通常采用的對菌體細(xì)胞的超聲破碎法以及對粗提DNA的微型柱純化法相比，既保證了一定提取與回收效率，又兼顧了DNA的質(zhì)量，使DNA在提取和純化過程中不會受到損傷。
4 海洋生物DNA的提取方法
海洋 是 地 球上最大的生物資源庫，同時由于海水的保護(hù)使海洋生物變化很少，物種得到較好的保存，這樣就為研究生命現(xiàn)象的基本問題提供了豐富的資料。在利用這些資源探討諸如生命的起源、生物進(jìn)化、生物與環(huán)境的關(guān)系、改造海洋生物以為人類服務(wù)(如生產(chǎn)某種藥物)時離不開對生物核酸的研究。對于海洋來源的動物、植物、微生物由于其不同于陸生生物的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點往往采用不同的DNA提取方法。
張海 琪 等 [31_在對不同方法保存的大黃魚(Pseudosciaena crocea)肌肉樣品基因組 DNA進(jìn)行提取時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)福爾馬林、乙醇及含有EDTA的乙醇保存的樣品可以同鮮活樣品和冷凍樣品一樣獲得基因組DNA，但相比之下采用乙醇作為固定劑更方便快速，所提取的DNA用于RAPD分析，獲得了滿意的效果。楊文新等[32〕利用75%的乙醇固定鮑魚(Haliotis discus)樣本并進(jìn)行DNA的提取，證明用乙醇固定海洋動物組織是一種切實可行的方法，材料處理后可同步提取，增加了實驗的同步性、可比性，適用于大量樣本的提取。由于組織中含有許多DNA酶，絕大多數(shù)DNA酶需要一個二價陽離子作為輔助因子，因此采用含適量EDTA的乙醇固定劑是野外標(biāo)本采集和運輸?shù)囊环N更簡便有效的方法。
韓兵 社 等 33:針對傳統(tǒng)的有機溶劑提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，應(yīng)用多種萃取液體系從廢棄物魷魚肝臟中提取核酸，與原工藝相比，核酸提取產(chǎn)量提高30%-60%，整體工藝得到簡化，而且避免了有機物的殘留。
赤 潮 是 在特定的環(huán)境前提條件下，海水中的某些浮游生物、原生動物或細(xì)菌爆發(fā)性增殖或高度聚集而引起水體變色的一種有害生態(tài)現(xiàn)象，對海洋漁業(yè)、水產(chǎn)資源以及人類的健康造成很大的威脅。發(fā)生赤潮的生物類型主要為藻類，銅綠微囊藻(Microcytis aeruginosa) 是造成赤潮的藻類之一。陸源等[34〕用乙醇乙醚混合液對純化的銅綠微囊藻作預(yù)處理，破壞了其膠質(zhì)鞘，從而使蛋白酶K和 SDS能更好地直接作用于其細(xì)胞壁，細(xì)胞內(nèi)的DNA釋放完全，提高了總DNA的得率。通過提取獲得的DNA有助于開展對有害藻類的研究，為防范赤潮提供依據(jù)。
在對 紫 菜 (Porphyras p.)進(jìn)行DNA提取時，郭寶太等[35〕先用海螺酶處理樣品制備紫菜體細(xì)胞，然后用SDS和蛋白酶K裂解細(xì)胞提取總DNA，再用Wizard DNA clean-up;樹脂進(jìn)行純化。經(jīng)海螺酶處理的紫菜細(xì)胞解決了通常采用的液氮破碎細(xì)胞后裂解物勃稠、DNA得率低且有嚴(yán)重的多糖污染等難題。但這種方法對植物組織需求量較多，不適于個體體積小的紫菜。劉必謙等[36〕采用美國Roche公司的DNA Isolation Kit for Cell and Tissue和上海生工公司的UNIQ- 10小量柱式基因組DNA提取試劑盒對個體體積較小的圓紫菜(Porphyra suborbiculato )、鐵釘菜(Ishige okamurae)等進(jìn)行DNA 的提取，獲得高純度的基因組DNA，完全能滿足酶切片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)技術(shù)的需要。
陳子 桂 等[371以海洋尾絲蟲(Uronema marinum)為材料，針對纖毛蟲難以建立培養(yǎng)以及個體豐度不高等特點，就微量條件下提取DNA的方法進(jìn)行了探討，成功地獲得了活體直接提取、活體酚/氯仿抽提、固定標(biāo)本直接提取以及固定標(biāo)本酚/氯仿抽提等四種簡便有效的微量DNA提取方法，解決了纖毛蟲微量DNA提取的困難。
綜合 DN A的提取方法，雖然不同生物 DNA的提取方法不盡相同，但各種提取方法也有很多相通之處，可以相互借鑒。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，對這一技術(shù)的經(jīng)驗總結(jié)將會越來越多，一些生物領(lǐng)域新的DNA提取方法也將逐漸固定下來，更為簡捷、高效的方法也必將出現(xiàn)，為基因工程提供更高純度的DNA.
