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lonza 無(wú)血清培養(yǎng)基 (點(diǎn)擊標(biāo)題進(jìn)入） 細(xì)胞治療所用的無(wú)血清培養(yǎng)基 （點(diǎn)擊標(biāo)題進(jìn)入） 干細(xì)胞治療所用的無(wú)血清培養(yǎng)基 （點(diǎn)擊標(biāo)題進(jìn)入）
Meenakshi Arora (arormx at UPMC dot EDU) University of Pittsburgh Medical Center, United States 譯者 王秀英 (mary at labome dot com) 美國(guó)新澤西州普林斯頓合原研究有限責(zé)任公司 (Synatom Research) DOI http://dx.doi.org/10.13070/mm.cn.3.175 日期 更新 : 2014-11-21; 原始版 : 2013-03-05 引用 實(shí)驗(yàn)材料和方法 2013;3:175 英文摘要 A comprehensive review of cell culture media and Labome survey results on cell culture media from 720 formal publications. 簡(jiǎn)介 細(xì)胞培養(yǎng)現(xiàn)在已成為應(yīng)用于生命科學(xué)的主要技術(shù)之一，它是從動(dòng)物或植物移取的細(xì)胞、組織或器官并將它們?cè)谟欣谏L(zhǎng)的人工環(huán)境中培養(yǎng)的統(tǒng)稱。細(xì)胞最適生長(zhǎng)的基本環(huán)境要求是：控制的溫度，良好的細(xì)胞附著基質(zhì)和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液和培養(yǎng)箱，能夠保持正確的pH值和滲透壓。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最重要和最關(guān)鍵的一步是選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液用于體外培養(yǎng)。生長(zhǎng)培養(yǎng)基或培養(yǎng)基是液體或凝膠狀態(tài)的，設(shè)計(jì)用于支持微生物、細(xì)胞或小的植株生長(zhǎng)。培養(yǎng)基是控制最佳的細(xì)胞生長(zhǎng)最重要和最復(fù)雜的因素。細(xì)胞培養(yǎng)基通常包括適當(dāng)?shù)募?xì)胞能量來(lái)源和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的化合物。一個(gè)典型的培養(yǎng)基還需要補(bǔ)充氨基酸，維生素，無(wú)機(jī)鹽，葡萄糖，和血清，以提供生長(zhǎng)因子，激素，和附著因子。除了營(yíng)養(yǎng)外，培養(yǎng)基也有助于保持培養(yǎng)體系中的pH值和滲透壓平衡。 細(xì)胞培養(yǎng)基的類型 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)可以使用純天然的培養(yǎng)基或人工/合成的培養(yǎng)基混合一些天然產(chǎn)物。 天然培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基僅由天然生成的生物液體組成。天然培養(yǎng)基非常有用和方便，適用于多種不同的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。但是，由于缺乏對(duì)這些天然培養(yǎng)基確切成分的認(rèn)識(shí)，使用天然培養(yǎng)基的主要缺點(diǎn)是可重復(fù)性差。 人工培養(yǎng)基 通過(guò)人為地加入一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（有機(jī)的和無(wú)機(jī)的）、維生素、鹽、O2和CO2氣體、血清蛋白、碳水化合物、輔因子，制備成人工或合成的培養(yǎng)基 [1] 。不同的人工培養(yǎng)基被分別設(shè)計(jì)用于下面的某個(gè)用途： · 及時(shí)生存（平衡的鹽溶液，有特定的pH和滲透壓） · 長(zhǎng)時(shí)間生存（平衡鹽溶液輔以各種配方的有機(jī)化合物和/或血清） · 不確定生長(zhǎng) · 特定功能。 培養(yǎng)基種類. 用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種各樣的人工培養(yǎng)基可以進(jìn)一步分為以下四種類型： 含血清的培養(yǎng)基：胎牛血清是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基最常見的補(bǔ)充成分。它用來(lái)作為一種成本相對(duì)較低的補(bǔ)充成分，提供動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)最佳的培養(yǎng)基。這些補(bǔ)充劑能夠?yàn)椴环€(wěn)定或不溶于水的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供載體或螯合劑，提供激素和生長(zhǎng)因子，蛋白酶抑制劑，并結(jié)合并中和有毒部分。 無(wú)血清培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中含有血清存在有很多缺點(diǎn)，可能會(huì)成為免疫學(xué)研究中潛在的嚴(yán)重誤解的原因 [2] [3] 。為了克服使用血清的這些缺點(diǎn)，一些無(wú)血清培養(yǎng)基中已經(jīng)開發(fā)出來(lái)了 [4] [5] 。這些培養(yǎng)基通常是專門配制的，用以單一類型細(xì)胞的培養(yǎng)，包含確定量的純化的生長(zhǎng)因子、脂蛋白和其它蛋白質(zhì)，而這些物質(zhì)本來(lái)是由血清提供的 [6] 。這些培養(yǎng)基也被稱為“確定的培養(yǎng)基”，因?yàn)檫@些培養(yǎng)基中的物質(zhì)是精確可知的。 確定化學(xué)成分的培養(yǎng)基：這些培養(yǎng)基包含無(wú)污染的超純無(wú)機(jī)和有機(jī)成分，也可能含有純蛋白質(zhì)添加劑，如生長(zhǎng)因子 [7] 。這些成分通過(guò)基因工程細(xì)菌或酵母生產(chǎn)，添加維生素、膽固醇、特定氨基酸和脂肪酸 [8] 。 無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基：無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基 含有任何蛋白質(zhì)，僅包含用于細(xì)胞培養(yǎng)所必需的非蛋白成分。相比血清培養(yǎng)基，無(wú)蛋白培養(yǎng)基促進(jìn)較好的細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)，并有利于下游的表達(dá)產(chǎn)物純化 [9] [10] [11] 。MEM，RPMI-1640等配方不含蛋白質(zhì)，需要時(shí)可補(bǔ)充蛋白質(zhì)。 不同類型的天然和人工培養(yǎng)基在表一中介紹。
表一：天然的和人工合成的培養(yǎng)基種類。 培養(yǎng)基的基本組成 培養(yǎng)基中混合有氨基酸、葡萄糖、鹽、維生素和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，供應(yīng)商可提供粉末或液體 [12] [13]。不同的細(xì)胞系對(duì)這些組分的要求有所不同，這些差別部分是由于大量的培養(yǎng)基配方 [14] 。每一成分擁有一個(gè)特定的功能，如下所述： 緩沖系統(tǒng) pH值調(diào)節(jié)對(duì)維持最佳培養(yǎng)條件是至關(guān)重要的，通常可用以下兩個(gè)緩沖系統(tǒng)中的一個(gè)達(dá)到這一目的： 天然緩沖系統(tǒng) 天然的緩沖系統(tǒng)中的氣態(tài)CO2與培養(yǎng)基中的CO3/HCO3含量維持平衡。使用天然緩沖系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)需要在5％至10％CO2環(huán)境下進(jìn)行，通常由CO2培養(yǎng)箱維持。天然的緩沖系統(tǒng)一般成本低、無(wú)毒 [15] 。 HEPES 化學(xué)緩沖液利用兩性離子做緩沖。HEPES在pH值范圍7.2-7.4內(nèi)具有優(yōu)異的緩沖能力，并且不需要受控的氣體環(huán)境 [16]。HEPES是相對(duì)昂貴的，并且在高濃度時(shí)對(duì)于某些類型的細(xì)胞是有毒的。 HEPES受到熒光照射的光敏效應(yīng)誘導(dǎo)后大大提高了對(duì)培養(yǎng)基的敏感性 [17] 。 酚紅 大多數(shù)市售的培養(yǎng)基含有酚紅作為pH指示劑，它能夠持續(xù)監(jiān)測(cè)pH值 [18] 。在細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中，由細(xì)胞釋放代謝物造成的pH值改變會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基的顏色變化。在低pH值時(shí)，酚紅使培養(yǎng)基變成黃，而在較高的pH值水平時(shí)，使培養(yǎng)基變成紫色。介質(zhì)在pH值7.4應(yīng)該是亮紅色，最適合細(xì)胞培養(yǎng)工作。但是，使用酚紅也有一定的缺點(diǎn)，如下所述： · 酚紅可以模仿一些類固醇激素，特別是雌激素的作用。因此，在用到雌激素敏感的細(xì)胞，如乳腺組織做研究的時(shí)候，最好是使用不含酚紅的培養(yǎng)基。 · 一些無(wú)血清的配方中存在酚紅會(huì)干擾鈉-鉀平衡。這種效應(yīng)可以通過(guò)在培養(yǎng)基中加入血清或牛垂體激素中和 · 酚紅會(huì)干擾流式細(xì)胞分析時(shí)候的檢測(cè)。 無(wú)機(jī)鹽 培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽有助于保持細(xì)胞的滲透平衡，通過(guò)提供鈉、鉀和鈣離子調(diào)節(jié)膜電位 [19]. 氨基酸 由于氨基酸是蛋白質(zhì)的組成部分，它們是所有已知細(xì)胞培養(yǎng)基的必需成分。培養(yǎng)基中必須包含必需氨基酸，因?yàn)榧?xì)胞不能自身合成。這些是細(xì)胞增殖必需的，其濃度決定了可達(dá)到的最大細(xì)胞密度。L-谷氨酰胺，作為一種必需氨基酸，在細(xì)胞培養(yǎng)是及其重要的 [20] 。 L-谷氨酰胺提供NAD，NADPH和核苷酸合成的氮元素，并作為新陳代謝的二次能量來(lái)源。 L-谷氨酰胺是一種不穩(wěn)定的氨基酸，隨著時(shí)間的推移，會(huì)轉(zhuǎn)換成細(xì)胞不能利用的形態(tài)，因此應(yīng)該在使用前添加到培養(yǎng)基中 [21] 。添加比原有培養(yǎng)基配方更多的L-谷氨酰胺的時(shí)候要特別小心，因?yàn)樗慕到鈺?huì)導(dǎo)致氨的生成，氨會(huì)對(duì)某些細(xì)胞系有害。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中的L-谷氨酰胺濃度可以從Medium 199中的0.68 mM到Dulbecco’s Modified Eagles的4 mM。無(wú)脊椎動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)基可包含高達(dá)12.32 mM的L-谷氨酰胺。有些補(bǔ)充成分，如glutamax更穩(wěn)定，可在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞時(shí)替代谷氨酰胺。 非必需氨基酸也可加入到培養(yǎng)基中，以替代那些在生長(zhǎng)過(guò)程中已被耗盡的成分。培養(yǎng)基中補(bǔ)充非必需氨基酸能夠刺激生長(zhǎng)，延長(zhǎng)細(xì)胞的生存。 糖類 糖類形式的碳水化合物是能量的主要來(lái)源。大多數(shù)培養(yǎng)基包含葡萄糖和半乳糖，而有一些含有麥芽糖和果糖。 蛋白質(zhì)和多肽 最常用的蛋白質(zhì)和肽是白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和纖連蛋白，在無(wú)血清培養(yǎng)基中特別重要。血清是一種蛋白質(zhì)豐富的來(lái)源，包括白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抑肽酶、胎球蛋白和纖維連接蛋白。白蛋白是血液中的主要蛋白，結(jié)合水，無(wú)機(jī)鹽，游離脂肪酸，激素和維生素，并將這些成分在組織和細(xì)胞間傳輸。白蛋白的結(jié)合能力使它成為從細(xì)胞培養(yǎng)基中去除有毒物質(zhì)有效途徑。 抑肽酶是細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的保護(hù)劑，在中性和酸性pH值環(huán)境下穩(wěn)定，耐高溫，耐蛋白水解酶降解。它對(duì)一些絲氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶）有抑制能力。胎球蛋白是一種糖蛋白，胎兒和新生兒的血清中的濃度比成人血清中高。它也是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑。纖維連接蛋白是細(xì)胞附著的關(guān)鍵組分。轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠?yàn)榧?xì)胞膜提供鐵離子。 脂肪酸和脂質(zhì) 同樣，它們?cè)跓o(wú)血清培養(yǎng)基中是特別重要的，因?yàn)樗鼈兺ǔ４嬖谟谘逯小?/span> 維生素 許多維生素是細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖必不可少的。細(xì)胞不能合成足夠數(shù)量的維生素，因此，是組織培養(yǎng)中重要的補(bǔ)充成分。血清同樣是細(xì)胞培養(yǎng)中維生素的主要來(lái)源，但是，培養(yǎng)基中也包含不同的豐富維生素，適用于某一特定細(xì)胞系的培養(yǎng)。維生素B群是生長(zhǎng)刺激最常見的添加維生素。 微量元素 無(wú)血清培養(yǎng)基中通常會(huì)補(bǔ)充微量元素，來(lái)代替那些血清中的常見成分。微量元素，如銅、鋅、硒和三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，都是適當(dāng)?shù)募?xì)胞生長(zhǎng)所必需的化學(xué)成分 [22] 。這些微量營(yíng)養(yǎng)元素是許多生物過(guò)程必需的，例如酶功能的維持。 培養(yǎng)基補(bǔ)充成分 某些細(xì)胞系推薦使用的完整生長(zhǎng)培養(yǎng)基還需要額外的成分，它們?cè)诨A(chǔ)培養(yǎng)基和血清中不存在。這些成分和補(bǔ)充物質(zhì)，有助于維持細(xì)胞增殖和細(xì)胞的正常代謝 [23] [24] 。雖然一些補(bǔ)充成分如激素，生長(zhǎng)因子和信號(hào)物質(zhì)是某些細(xì)胞系正常生長(zhǎng)所需的，但最好還是要采取以下一些預(yù)防措施： 由于添加補(bǔ)充成分會(huì)改變完整生長(zhǎng)培養(yǎng)基的滲透壓，這會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響，因此最好在添加補(bǔ)充成分后重新檢測(cè)一下滲透壓。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系，最佳的滲透壓應(yīng)該介于260 mOSM/kg到320 mOSM/kg之間。 添加補(bǔ)充成分后培養(yǎng)基的保質(zhì)期會(huì)發(fā)生變化。含蛋白質(zhì)補(bǔ)充物的完整培養(yǎng)基降解速度往往比基本培養(yǎng)基快。 抗生素 雖然不是細(xì)胞生長(zhǎng)必需的，抗生素通常還是會(huì)用來(lái)控制細(xì)菌和真菌污染物生長(zhǎng) [25] 。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)不建議使用抗生素，因?yàn)榭股乜梢匝谏w由支原體和耐藥細(xì)菌造成的污染 [26] [27] 。此外，抗生素還會(huì)干擾敏感細(xì)胞的代謝。 培養(yǎng)基中的血清 血清是白蛋白、生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)抑制劑的復(fù)雜混合體 [28] 。血清是細(xì)胞培養(yǎng)基中最重要的組分之一，作為氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素（特別是脂溶性維生素，如A，D，E，和K）、碳水化合物、脂質(zhì)、激素、生長(zhǎng)因子、礦物質(zhì)和微量元素的來(lái)源。通常會(huì)在培養(yǎng)基中使用胎兒和小牛來(lái)源的血清來(lái)支持細(xì)胞生長(zhǎng) [29] 。胎兒血清含有豐富的生長(zhǎng)因子，適當(dāng)細(xì)胞克隆和難以培養(yǎng)的細(xì)胞的生長(zhǎng) [30] 。胎兒血清被用于接觸抑制研究，因?yàn)樗^低的生長(zhǎng)促進(jìn)特性。正常的生長(zhǎng)培養(yǎng)基往往包含2-10％的胎兒血清。培養(yǎng)基中補(bǔ)充血清具有以下作用 [31] ： · 血清未細(xì)胞提供了基本的營(yíng)養(yǎng)成分（在溶液中和結(jié)合到蛋白質(zhì)上的）。 · 血清為生長(zhǎng)促進(jìn)和特定細(xì)胞功能提供多種生長(zhǎng)因子和激素。 · 它提供了多種結(jié)合蛋白質(zhì)，如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白，可以攜帶其他成分進(jìn)入細(xì)胞。例如：白蛋白可攜帶脂類、維生素、激素等進(jìn)入細(xì)胞。 · 它還可提供蛋白質(zhì)，如纖連蛋白，促進(jìn)細(xì)胞附著到基質(zhì)上。它提供擴(kuò)散因子幫助細(xì)胞在分裂前擴(kuò)散。 · 它還提供蛋白酶抑制劑，保護(hù)細(xì)胞免受降解。 · 它還提供礦物質(zhì)，如Na+，K+，Zn2 +，Fe2 +等。 · 它增加培養(yǎng)基的粘性，因此保護(hù)細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)攪拌過(guò)程中免受機(jī)械損傷。 · 它還可以作為一種緩沖液。 由于存在生長(zhǎng)因子和酶抑制劑，血清在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用是非常復(fù)雜的。不幸的是，除了提供各種功能，在組織培養(yǎng)中使用血清也有一些缺點(diǎn) [32] [33] [10]. 表
表二：培養(yǎng)基中使用血清的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。 培養(yǎng)基的準(zhǔn)備 供應(yīng)商那里有三種形式的培養(yǎng)基： 1. 粉末狀態(tài)：需要研究人員準(zhǔn)備和滅菌。 2. 濃縮狀態(tài)：由研究人員稀釋。 3. 工作液：可直接使用不許其他操作。 粉狀介質(zhì)是最便宜的，但需要進(jìn)行滅菌[34] 。可取的做法是，在加入血清前先過(guò)濾除菌，因?yàn)檠宕嬖谙碌陌l(fā)泡作用會(huì)使蛋白質(zhì)變性。胎牛血清或馬血清可以在過(guò)濾后加入。培養(yǎng)基在使用前始終要進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)，方法是將其放置在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，以確保該批次是未被污染的。培養(yǎng)基應(yīng)在4℃下保存。由于培養(yǎng)基的部分成分是光敏感的，應(yīng)貯存在黑暗環(huán)境下。 培養(yǎng)基的選擇標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞系 細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇非常重要，會(huì)顯著影響細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的成敗 [35]. 培養(yǎng)基的選擇依賴于要培養(yǎng)的細(xì)胞的類型和培養(yǎng)目的和實(shí)驗(yàn)室可用的資源 [36] [37]. 不同的細(xì)胞類型有高度特異的生長(zhǎng)要求，因此，每種類型細(xì)胞的最適培養(yǎng)基必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)決定 [38] [39].總體來(lái)說(shuō)，MEM適用于粘附生長(zhǎng)的細(xì)胞，而RPMI-1640適合懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞。表三描述了普通研究的細(xì)胞系以及推薦的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
表三：常見細(xì)胞系以及推薦的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。 原代細(xì)胞培養(yǎng) 原代細(xì)胞培養(yǎng)提供了獨(dú)特的，有價(jià)值的研究數(shù)據(jù)，但大多數(shù)情況下細(xì)胞數(shù)是限制因素。對(duì)于這些難以培養(yǎng)的樣品，尤其是病人活組織切片，培養(yǎng)基質(zhì)量是必需的。多數(shù)生命科學(xué)公司提供完整的能夠直接使用的，補(bǔ)充成分充足的條件培養(yǎng)基。這降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)，通過(guò)減少準(zhǔn)備步驟和需要的補(bǔ)充成分，也節(jié)省了時(shí)間、人力和投入。此外，所有這些培養(yǎng)基都進(jìn)行了全面的質(zhì)量控制測(cè)試，每批都會(huì)常規(guī)檢測(cè)生長(zhǎng)促進(jìn)，沒(méi)有細(xì)胞毒性以及一些物理參數(shù)，如滲透壓和pH值水平。表四描述了由不同公司提供的用于常見原代細(xì)胞培養(yǎng)的推薦培養(yǎng)基。
表四：常見原代細(xì)胞的推薦培養(yǎng)基。 普通細(xì)胞培養(yǎng)基 大多數(shù)常用的培養(yǎng)基包括下述的如Sigma, ATCC和Life Technologies ，都有詳細(xì)討論。 Eagle’s 最低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基 (EMEM) EMEM是第一個(gè)被廣泛使用的培養(yǎng)基，由Harry Eagle從簡(jiǎn)單的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BME）配制而成。 EMEM包含平衡鹽溶液，非必需氨基酸和丙酮酸鈉。它降低了碳酸氫鈉濃度 (1500 ml/l)，從而使用5％的CO2。由于EMEM是一個(gè)非復(fù)雜培養(yǎng)基，所以一般會(huì)額外補(bǔ)充一些添加物或更高水平的血清，使其適用于多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 Dulbecco’s 改進(jìn) Eagle’s 培養(yǎng)基 (DMEM) DMEM培養(yǎng)基比EMEM多幾乎2倍的氨基酸的和4倍的維生素，以及硝酸鐵，丙酮酸鈉和一些補(bǔ)充氨基酸。最初的制劑含有1,000 mg / L的葡萄糖，首次報(bào)道用于培養(yǎng)小鼠胚胎細(xì)胞。進(jìn)一步的變化是4500 mg / L濃度的葡萄糖，已被證明用于培養(yǎng)各類細(xì)胞是最佳的。 DMEM是基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不包含蛋白質(zhì)或生長(zhǎng)促進(jìn)劑。因此，需要補(bǔ)充一些成分成為 “完全”培養(yǎng)基。最常見的是補(bǔ)充5-10％的胎牛血清（FBS）。 DMEM中利用碳酸氫鈉緩沖液（3.7 g/L），因此，需要人工保持二氧化碳水平以維持所需的pH值。粉末狀的培養(yǎng)基 含有碳酸氫鈉，因?yàn)樗诜勰顟B(tài)傾向于釋放氣體。粉狀培養(yǎng)基需要溶解后加入3.7 g / L的碳酸氫鈉。 DMEM最初用于小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)。現(xiàn)在已經(jīng)在原代小鼠和雞細(xì)胞，病毒蝕斑形成和接觸抑制的研究中廣泛應(yīng)用。 RPMI-1640 RPMI-1640是一個(gè)通用的用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基，尤其是造血干細(xì)胞。RPMI-1640是在紐約州布法羅市的羅斯韋爾公園紀(jì)念研究所（RPMI）開發(fā)出來(lái)的。 RPMI-1640是改良的McCoy’s 5A，用于外周血淋巴細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)。RPMI-1640使用碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)，不同于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的地方在于其典型的pH8的配方。RPMI-1640支持各種各樣的細(xì)胞在懸浮液中單層生長(zhǎng)。如果適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充血清或足夠的血清替代品，RPMI-1640在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)中應(yīng)用廣泛，包括新鮮的人淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)，融合實(shí)驗(yàn)，雜交細(xì)胞的生長(zhǎng)。 Ham’s 營(yíng)養(yǎng)混合液 這些最初開發(fā)用于支持中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞的克隆產(chǎn)物。現(xiàn)在已有相當(dāng)多的原有培養(yǎng)的改良版，包括Hams’s F-12培養(yǎng)基，比原來(lái)的F-10配方更復(fù)雜適用于無(wú)血清的增殖。根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的不同，混合液配制成需要血清和不需要血清兩種。 Ham’s F-10：被證實(shí)能夠支持人二倍體細(xì)胞核白細(xì)胞的生長(zhǎng)，用于染色體分析。 Ham’s F-12：已被證明支持原代大鼠肝細(xì)胞和大鼠前列腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。Ham’s F-12補(bǔ)充25 mM HEPES提供更優(yōu)化的緩沖環(huán)境。 Coon’s 改良Ham’s F-12：它幾乎兩倍于F-12的氨基酸和丙酮酸，還包括抗壞血酸。它被開發(fā)用于培養(yǎng)病毒融合產(chǎn)生的雜交細(xì)胞。 DMEM/F12：它是DMEM和Ham’s F-12的混合物，是極其豐富和復(fù)雜的培養(yǎng)基。支持多種類型細(xì)胞在含血清和無(wú)血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。終濃度為15mM的HEPES緩沖液包含在培養(yǎng)基中，以補(bǔ)償血清減少造成的緩沖能力下降。 Iscove’s 改良 Dulbecco’s 培養(yǎng)基 (IMDM) IMDM是非常豐富的合成培養(yǎng)基，非常適合于快速增殖，高密度細(xì)胞培養(yǎng)。 IMDM培養(yǎng)基是DMEM的改良版，含有硒，跟DMEM相比含有額外的氨基酸，維生素和無(wú)機(jī)鹽。它含有硝酸鉀代替硝酸鐵，并且還含有HEPES和丙酮酸鈉。它配置為了支持淋巴細(xì)胞和雜交瘤的生長(zhǎng)。研究表明，IMDM可以支持小鼠B淋巴細(xì)胞，從骨髓中的造血組織，脂多糖刺激B細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞，以及各種雜交細(xì)胞。
表五：常見培養(yǎng)及及其應(yīng)用。 細(xì)胞培養(yǎng)基的優(yōu)化 細(xì)胞培養(yǎng)基組成成分的復(fù)雜性為優(yōu)化培養(yǎng)基的個(gè)別成分提出了挑戰(zhàn)。多數(shù)的經(jīng)典培養(yǎng)基是為小規(guī)模低密度的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的，往往需要血清作為主要營(yíng)養(yǎng)成分。然而，生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)卻要求保持高細(xì)胞密度和高細(xì)胞生產(chǎn)力，因此開發(fā)和優(yōu)化培養(yǎng)基是非常關(guān)鍵的 [40] 。典型的，用于生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的培養(yǎng)基使不含血清的，也比傳統(tǒng)培養(yǎng)基含大量濃度更高的營(yíng)養(yǎng)成分 [41] [42] 。培養(yǎng)基的優(yōu)化需要考慮以下參數(shù)： 要生產(chǎn)的產(chǎn)物 所需產(chǎn)品的類型將決定培養(yǎng)基的優(yōu)化策略。 對(duì)于細(xì)胞數(shù)的快速增長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和生存能力是至關(guān)重要的。因此，細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)支持最大程度細(xì)胞的生長(zhǎng)，并維持細(xì)胞密度增加后的細(xì)胞活力。 用于生產(chǎn)病毒，不僅僅要求高細(xì)胞密度，還必須有豐富的營(yíng)養(yǎng)來(lái)維持病毒感染后的復(fù)制。 對(duì)于重組蛋白生產(chǎn)，高細(xì)胞密度是必需的。然而，細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)與蛋白生產(chǎn)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)。因此，要仔細(xì)確定一個(gè)給定培養(yǎng)基可以維持的最大細(xì)胞密度達(dá)到所需的生產(chǎn)力水平是非常重要的。此外，在培養(yǎng)基優(yōu)化過(guò)程中一定不影響產(chǎn)品質(zhì)量，也是需要考慮的重要因素。 用到的細(xì)胞株 不同細(xì)胞株因?yàn)樾玛惔x不同有不同的營(yíng)養(yǎng)需求，這就決定了培養(yǎng)基優(yōu)化方法的差異。在生物技術(shù)工業(yè)中使用最常見的細(xì)胞株有CHO細(xì)胞，BHK-21，雜交瘤細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞和正常二倍體成纖維細(xì)胞。特定細(xì)胞系具有特定的營(yíng)養(yǎng)要求，如NS0骨髓瘤細(xì)胞需要膽固醇。正常二倍體成纖維細(xì)胞需要附著因子粘附，并且在表面生長(zhǎng)擴(kuò)散。它們的生長(zhǎng)密度很低，因此，不需要在高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。雜交瘤細(xì)胞系通常高度依賴于谷氨酰胺。他們通常在達(dá)到細(xì)胞密度高峰后沒(méi)有平臺(tái)期，生存能力會(huì)迅速下降。因此培養(yǎng)基的優(yōu)化，從而會(huì)降低細(xì)胞活力的下降，并提高單克隆抗體的產(chǎn)量。 包含的制造工藝 制造工藝模式不僅會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇，也會(huì)影響到優(yōu)化步驟。使用的不同的制造工藝是： 分批處理：?jiǎn)我坏呐囵B(yǎng)基用來(lái)維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和生產(chǎn)力。因此培養(yǎng)基應(yīng)該營(yíng)養(yǎng)成分豐富但需要維持細(xì)胞的生理極限。 分批補(bǔ)料：幾種類型的培養(yǎng)基根據(jù)生產(chǎn)階段的不同分別用于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中。生長(zhǎng)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)是這樣的，在接種是細(xì)胞密度低，它的營(yíng)養(yǎng)成分濃度也較低，但在細(xì)胞生長(zhǎng)期間和生產(chǎn)早期維持細(xì)胞的快速生長(zhǎng)。在培養(yǎng)達(dá)到生產(chǎn)階段時(shí)，單獨(dú)的比生長(zhǎng)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)濃度更高的生產(chǎn)培養(yǎng)基也會(huì)用到。 培養(yǎng)基發(fā)展的挑戰(zhàn) 在過(guò)去的幾十年中，細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)得到了驚人的進(jìn)步。找到一個(gè)良好的細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)的整體效果來(lái)說(shuō)非常重要的。今天的挑戰(zhàn)是開發(fā)復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)基，并可以進(jìn)行單獨(dú)優(yōu)化以用于一系列的細(xì)胞培養(yǎng)上。細(xì)胞系的多樣性以及涉及到大量的培養(yǎng)基成分使得這個(gè)工作非常困難。事實(shí)上，由于細(xì)胞代謝途徑的復(fù)雜性，許多成分是相互依存的，這也為復(fù)雜性更添了一層。 參考文獻(xiàn) 1. Morgan J, Morton H, Parker R. Nutrition of animal cells in tissue culture; initial studies on a synthetic medium. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8 pubmed 2. Kerbel R, Blakeslee D. Rapid adsorption of a foetal calf serum component by mammalian cells in culture. A potential source of artifacts in studies of antisera to cell-specific antigens. Immunology. 1976;31:881-91 pubmed 3. Sula K, Draber P, Nouza K. Addition of serum to the medium used for preparation of cell suspensions as a possible source of artifacts in cell-mediated reactions studied by means of the popliteal lymph node test. J Immunogenet. 1980;7:483-9 pubmed 4. Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Commercial serum-free media: hybridoma growth and monoclonal antibody production. J Immunol Methods. 1991;145:175-83 pubmed 5. Barnes D, Sato G. Methods for growth of cultured cells in serum-free medium. Anal Biochem. 1980;102:255-70 pubmed 6. Iscove N, Melchers F. Complete replacement of serum by albumin, transferrin, and soybean lipid in cultures of lipopolysaccharide-reactive B lymphocytes. J Exp Med. 1978;147:923-33 pubmed 7. Nagle S. Heat-stable chemically defined medium for growth of animal cells in suspension. Appl Microbiol. 1968;16:53-5 pubmed 8. Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Systematic improvement of a chemically-defined protein-free medium for hybridoma growth and monoclonal antibody production. J Biotechnol. 1996;45:111-23 pubmed 9. Darfler F. A protein-free medium for the growth of hybridomas and other cells of the immune system. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78 pubmed 10. Barnes D, Sato G. Serum-free cell culture: a unifying approach. Cell. 1980;22:649-55 pubmed 11. Hamilton W, Ham R. Clonal growth of chinese hamster cell lines in protein-free media. In Vitro. 1977;13:537-47 pubmed 12. Ham R, McKeehan W. Media and growth requirements. Methods Enzymol. 1979;58:44-93 pubmed 13. Heby O, Emanuelsson H. Role of the polyamines in germ cell differentiation and in early embryonic development. Med Biol. 1981;59:417-22 pubmed 14. Eagle H. Nutrition needs of mammalian cells in tissue culture. Science. 1955;122:501-14 pubmed 15. Howorth P. The physiological assessment of acid-base balance. Br J Dis Chest. 1975;69:75-102 pubmed 16. Shipman C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 1969;130:305-10 pubmed 17. Zigler J, Lepe-Zuniga J, Vistica B, Gery I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7 pubmed 18. Reznikov B. [Incubation of Brucella on solid nutrient media with a phenol red indicator]. Veterinariia. 1972;7:109-10 pubmed 19. Cinatl J. Inorganic-organic multimolecular complexes of salt solutions, culture media and biological fluids and their possible significance for the origin of life. J Theor Biol. 1969;23:1-10 pubmed 20. Lane C, Pax R, Bennett J. L-glutamine: an amino acid required for maintenance of the tegumental membrane potential of Schistosoma mansoni. Parasitology. 1987;94:233-42 pubmed 21. Pasieka A, Morgan J. Glutamine metabolism of normal and malignant cells cultivated in synthetic media. Nature. 1959;183:1201-2pubmed 22. Sternberg J, Benoit J, Mercier A, PAQUETTE J. ROLE OF SOME TRACE ELEMENTS (ZINC AND COBALT) IN THE GROWTH OF B.C.G. Rev Can Biol. 1964;23:353-65 pubmed 23. Bettger W, Boyce S, Walthall B, Ham R. Rapid clonal growth and serial passage of human diploid fibroblasts in a lipid-enriched synthetic medium supplemented with epidermal growth factor, insulin, and dexamethasone. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981;78:5588-92 pubmed 24. Bottenstein J, Hayashi I, Hutchings S, Masui H, Mather J, McClure D, et al. The growth of cells in serum-free hormone-supplemented media. Methods Enzymol. 1979;58:94-109 pubmed 25. Perlman D. Use of antibiotics in cell culture media. Methods Enzymol. 1979;58:110-6 pubmed 26. McGarrity G. Spread and control of mycoplasmal infection of cell cultures. In Vitro. 1976;12:643-8 pubmed 27. Masters J, Stacey G. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2007;2:2276-84 pubmed 28. Lane B, Miller S. Preparation of large numbers of uniform tracheal organ cultures for long term studies. I. Effects of serum on establishment in culture. In Vitro. 1976;12:147-54 pubmed 29. von Seefried A, Macmorine H. The use of foetal, calf and adult bovine sera for the growth of serially subcultivated diploid cells. Dev Biol Stand. 1976;37:83-9 pubmed 30. Hornsby P, Sturek M, Harris S, Simonian M. Serum and growth factor requirements for proliferation of human adrenocortical cells in culture: comparison with bovine adrenocortical cells. In Vitro. 1983;19:863-9 pubmed 31. Kragh-Hansen U. Molecular aspects of ligand binding to serum albumin. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53 pubmed 32. Ulreich J, Chvapil M. Altered activity in cultured cells caused by contaminants in tubes widely used for blood collection and serum preparation. In Vitro. 1982;18:117-21 pubmed 33. Sandstrom C, Miller W, Papoutsakis E. Serum-free media for cultures of primitive and mature hematopoietic cells. Biotechnol Bioeng. 1994;43:706-33 pubmed 34. Kenny C, Diena B, Greenberg L. Autoclaving: a modification in the preparation of tissue culture medium 199. Can J Microbiol. 1972;18:272-3 pubmed 35. Weller T, Wheeldon S. The cultivation in vitro of cells derived from adult Schistosoma mansoni. I. Methodology; criteria for evaluation of cultures; and development of media. Am J Trop Med Hyg. 1982;31:335-48 pubmed 36. Yang H. [Selection of culture media for human and rabbit corneal epithelia]. Zhonghua Yan Ke Za Zhi. 1991;27:351-3 pubmed 37. Clifford W, Anellis A, Ross E. Evaluation of media, time and temperature of incubation, and method of enumeration of several strains fo Clostridium perfringens spores. Appl Microbiol. 1974;27:784-92 pubmed 38. Schumpp B, Schlaeger E. Optimization of culture conditions for high cell density proliferation of HL-60 human promyelocytic leukemia cells. J Cell Sci. 1990;97:639-47 pubmed 39. McKeehan W, Barnes D, Reid L, Stanbridge E, Murakami H, Sato G. Frontiers in mammalian cell culture. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:9-23 pubmed 40. Chambers S, Swalley S. Designing experiments for high-throughput protein expression. Methods Mol Biol. 2009;498:19-29pubmed publisher 41. Keen M, Rapson N. Development of a serum-free culture medium for the large scale production of recombinant protein from a Chinese hamster ovary cell line. Cytotechnology. 1995;17:153-63 pubmed publisher 42. Jayme D, Watanabe T, Shimada T. Basal medium development for serum-free culture: a historical perspective. Cytotechnology. 1997;23:95-101 pubmed publisher ISSN : 2329-5147
lonza 無(wú)血清培養(yǎng)基 (點(diǎn)擊標(biāo)題進(jìn)入） 細(xì)胞治療所用的無(wú)血清培養(yǎng)基 （點(diǎn)擊標(biāo)題進(jìn)入） 干細(xì)胞治療所用的無(wú)血清培養(yǎng)基 （點(diǎn)擊標(biāo)題進(jìn)入） |
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