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動物細胞培養
前 言
v 1885年Roux最早嘗試使組織離體培養，材料是雞胚神經板，采用生理鹽水為培養液，并首次采用組織培養這個術語。
v 1907年Harrison 和1912年Carrel開始把組織培養作為一種方法，用于研究離體動物細胞的培養。
v 由于組織培養在醫學研究中的應用，如抗病毒疫苗的生產等，現已經逐漸發展成為一門精細技術。許多細胞株、細胞系的培育成功，尤其是以人的腫瘤組織為材料建立的各種細胞系，如Hela細胞系（Gey，1952），可用來進行一系列研究，更加促進了組織培養技術的發展。
組織培養中熱門的研究領域
1)細胞內部的活動，如DNA的復制和轉錄、蛋白質合成、能量代謝；
2)細胞內部的流動，如RNA從細胞核向細胞質方向運轉，激素受體復合物的易位等；
3)生態學，如營養、感染、病毒或化學誘變、藥物作用；
4)細胞與細胞之間的相互作用，如胚胎誘導、細胞群體的動力學等。
組織培養的分類及基本概念
分類:
1.組織培養(Tissue Culture) 指的是從體內取出組織，在模擬體內生理環境，無菌、適當溫度和一定營養條件下，使之生存和生長并維持其結構和功能的方法。
2.細胞培養(Cell Culture) 培養物是單個細胞和細胞群。
3.器官培養（Organ Culture） 培養的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。
組織培養的細胞生物學特點
體內外細胞的差異：當人工條件和體內實際情況不完全相同時，細胞在體外培養后，一旦失去神經體液調節和細胞間相互影響，生活在缺乏動態平衡的環境中，發生變化則是必然。細胞最多見的表現是：返祖（Atavism）現象，即失去原有組織結構和細胞形態、分化減弱或不顯、細胞趨單一化、不死性、惡性狀。
2.細胞增殖和分化：是細胞生命進化中所獲得的基本屬性，增殖使細胞數量增多；分化使機體結構和功能多樣化，最后演變成完整的有機體。
培養細胞的分化
細胞分化機制是極其復雜的，是在細胞與細胞、細胞與體液和細胞與細胞外基質相互作用下，眾多基因參與、經過多階段和多環節完成的動態演變過程。
v 不適應（Deadaption）
細胞在體內時所擁有的分化特性減弱或不顯。例如肝細胞在體外喪失了產生酪氨酸轉移酶的特性。
v 脫分化（去分化）（Dedifferentiation）
由于基因變異而使細胞失去分化能力。如肝細胞失掉產生精氨酸酶及氨基酸轉移酶的特性后，儲存肝糖元的能力喪失，并很難再現。
v 不適應和脫分化兩個概念不同：不適應是因為生存條件改變而使分化發生抑制；從分子水平考慮，脫分化很可能是基因變異所致。
培養細胞的形態
1.貼附型：
1）成纖維細胞：心肌細胞，血管內皮細胞等
2）上皮型細胞：消化管外皮細胞，肝臟上皮細胞等
3）游走型細胞：神經膠質細胞
4）多形型細胞：神經組織細胞
2.懸浮型：如癌細胞
培養細胞的生長和增殖
.原代培養（Primary Culture）階段：或稱初代培養。從體內取出組織接種培養到第一次傳代，隨不同的組織時間長短不一，一般為1~4w
2.傳代培養（Subculture）階段：或稱繼代培養。也就是細胞系（Cell line）階段，細胞增殖旺盛，一般細胞可傳代10-50代）。
.衰退階段：
自發性轉化（Spontaneous Transformation）：其標志是獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）: 細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系(Infinite cell line)或連續細胞系(Continuous cell line)。
如：BHK（倉鼠腎成纖維細胞），F9（小鼠胚胎癌細胞），M2R（黑色素瘤細胞）等。
培養細胞的傳代培養
v 當細胞生長達到一定密度后，都需要做傳代處理，傳代的頻率或間隔與培養液的性質、接種細胞的數量和細胞增殖速度有關。
v 所謂細胞“一代”，即從細胞接種到分離再培養的一段時間。如某一細胞系為50代即該細胞已傳代50次。
細胞傳代的三個階段
）潛伏期（Latent phase）：
細胞從接種到貼壁生長繁殖的一段時間。
二倍體細胞該期時間長（24~96h）；
連續細胞系時間短（10~30min）
2) 指數生長期（Logarthmic growth phase）：
細胞增殖最旺盛時期，一般用細胞分裂指數（Mitotic index，MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數。體外培養細胞分裂指數介于0.1~0.5%，且受細胞種類培養液成分、pH、溫度等影響。
v 指數生長期是細胞活力最好的時期，在接種細胞數量適宜情況下，指數生長期持續3-5d后，隨細胞數量不斷增多，生長空間日趨減少，細胞相互接觸匯合成片，呈現接觸抑制（Contact inhibition）。而惡性細胞則無接觸抑制現象，因此接觸抑制可作為區分正常與癌細胞標志之一。
v 癌細胞則由于營養成分的消耗和細胞代謝產物的影響而發生密度抑制（Density inhibition
3)停滯期（Stagnate phase）：
即細胞數量達到飽和密度后，細胞與營養液的交換面積減少，代謝產物積累，PH下降細胞停止增殖，進入停滯期。在此時應及時進行換液傳代，否則因細胞中毒受損，大量細胞出現死亡，至少再傳1-2代后，細胞才能恢復。
細胞培養的基本條件
1)儀器和設備:
常規的細胞培養設備：如CO2孵箱；
培養器材：如培養瓶，純水設備，干燥消毒除菌設備，清洗設備等。
2)培養液:目前常用的基礎培養液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根據培養需求合理選擇。
3)血清：一般常用為小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它動物血清。
由于不同的研究目的，血清成分往往干擾研究實驗，如進行藥物和受體及營養等方面的研究時，需要使用無血清培養基。
4)平衡鹽溶液:主要用于作為稀釋和灌注的液體，維持細胞滲透壓，提供緩沖系統，使培養液的酸監度維持在培養細胞生理范圍內，提供細胞正常代謝所需的水分和無機離子等。
常用的有PBS，Hank’s等。
5)抗生素:常用為青霉素（每毫升培養液50~100單位）和鏈霉素（每毫升培養液50~100微克）。
6)其它添加成分：
緩沖系統，常用為HEPES（N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonic acid），緩沖效能(pKa)在20℃時為7.55，37℃為7.31； HEPES不是起維持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH變化的，所以調整pH常常用NaHCO3溶液。
有機補充物，如丙酮酸鈉， 谷胺酰氨等。
促細胞分裂因子，如生長因子類的FGF(成纖維細胞生長因子)，EGF(表皮生長因子)。
貼壁和鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等。
可根據培養細胞的特殊要求進行添加。
培養液的物理性質
v pH值：大多數細胞在pH7.4時生長最好，一般不低于6.8，不高于7.6。酚紅是常用的指示劑，用來檢測PH的變化：紅色--pH7.4，橙色--pH7.0，黃色--pH6.5，藍紅色--pH7.6，紫色--pH7.8。
v 溫度：溫度除直接影響細胞生長外，還與培養液的pH值有關，溫度低時CO2溶解性增加，從而影響pH。
v 滲透壓：培養液滲透壓一般介于260~320 mosm/kg之間。
人類血漿滲透壓290mosm /kg，小鼠類為310mosm /kg。
v 粘度：由于血清的存在，直接影響培養液粘度。
v 表面張力：培養液的表面張力有利于培養物粘著于底物上面。
細胞培養的基本方法
.組織、細胞的解離方法
1.1 解離組織：在無菌情況下采取動物的組織或器官，放在含有抗生素的平衡鹽溶液(BSS)中，然后盡快在超凈臺或無菌室內進行解離處理。
解離時應注意:
1) 盡可能將脂肪和壞死組織去除干凈；
2) 剪碎組織時，避免損傷組織塊；
3) 解離組織用的各種酶系，需要先進行低速離心。
解離細胞
常用酶和鰲合劑進行解離：
當實驗室需要制備具有均勻細胞層的培養物；
從單個細胞出發獲得細胞群體；
從一定量的組織中獲得最多的細胞量時。
解離細胞的方法
）胰蛋白酶解離細胞法：所需時間較短，主要缺點是破損細胞。
2）膠原酶解離細胞法：這種方法對解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的。膠原酶最終濃度200u/ml，36.5℃溫育，一般溫育4-48h。膠原酶和透明質酸酶協同作用有助于分離大鼠或兔的肝臟組織。
3）機械解離細胞法：比酶法所需時間短，但細胞存活率較低。
4）螯合劑解離細胞法：分離效果差
原代細胞培養
1）外植塊培養：外植塊在一定限度內可保持其原有組織結構，有利于其適應體外培養環境。短期培養的外植塊成為細胞培養的材料來源之一。
2）單層細胞培養：每隔1~3d換液一次，細胞長成單層后傳代培養。
3）懸浮細胞培養：使細胞成懸浮狀態在培養液中連續生長。
v 由于細胞本身是不粘附的，如小鼠白血病細胞和腹水腫瘤細胞；
v 通過機械攪動使細胞保持懸浮狀態；
v 通過選擇培養得到能懸浮生長的細胞進行懸浮培養。
細胞培養中應注意的幾個問題
1）培養液和培養物的比例：一定濃度的培養液僅能支持一定數量的細胞生長，不能盲目增加每單位體積的細胞濃度。
2）PH：初培養pH應為7.4，培養過程應不低于7.0。
3）培養瓶內的空間：一般培養瓶內培養液與液面上的空間體積之比為1:10
4）容積、深度、表面面積：培養液體積與表面面積的比例為0.2~0.5ml/cm2。需高濃度氧的，在淺的培養液（2mm）中生長較好；需要低濃度氧的。在深的培養液（5mm）中生長較好。
5）去除死細胞
6）溫度控制：動物細胞培養對溫度波動的敏感性很大。溫度低于36.5℃，細胞生長緩慢；溫度高于37.5℃，細胞存活力降低。
細胞系及其鑒定
原代培養的培養物中所含的細胞類型多而復雜。因此在培養初期，存活和生長的細胞類型也是多種多樣的。所以再培養不僅僅是為了維持細胞不斷地生長，而且是使培養物逐步成為具有增殖能力、特征專一、類型均勻的培養細胞，即細胞系(Cell line)。
細胞克隆技術
v 培育細胞系可采用細胞克隆技術。
v 一個克隆的細胞群體是從一個單一母細胞繁殖而來，分離單一細胞并使其繁殖為一細胞群體的方法稱為克隆化(cloning)。
細胞克隆技術的方法
1.稀釋鋪板法
2.飼養層克隆法
3.膠原膜板或纖維蛋白膜板克隆法
4.瓊脂克隆法
5.在瓊脂基底上用甲基纖維素克隆法
細胞系鑒定
當細胞系建立后，應對細胞系進行一系列鑒定后，才能應用于細胞生物學、免疫學、細胞遺傳學等方面的研究。鑒定內容應包括:
1)細胞系的細胞來源；
2)鑒定細胞系的純度，即除了主類細胞外，還雜有哪類細胞；
3)細胞系的穩定性，即在細胞連續培養過程中主要指標應無明顯變化；
4)累積細胞系的形態及其表達特征的基本數據，以及其與來源細胞的差異等；
細胞系鑒定指標
1.形態學：活細胞觀察；固定染色觀察培養細胞。
2.染色體：
染色體是一種鑒定細胞系的種屬、性別來源較為確切的指標；也是檢查細胞系是否趨于穩定，在離體培養條件下細胞有否發生轉化的可靠指標；是區別正常細胞與惡性細胞的指標。
采用染色體數目、核型分析以及染色體分帶技術檢測。
3.同工酶譜：
通常采用G6PD(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、LDH(乳酸脫氫酶)、核苷磷酸化酶三種方法，根據條件選擇。
4.細胞DNA遺傳特征:
限制性片斷長度多態性(restriction fragment length polymorphism RFLP) 是指那些在生物進化過程中，DNA序列發生某些中性突變，突變的結果是失去或獲得一個酶切點，因此當基因組DNA用限制性內切酶酶切后，限制性內切酶片斷加長或縮短；用同源的克隆DNA為探針可以探測出來。另外也可能在生物進化過程中DNA分子結構發生重排，使DNA堿基排列序列改變，影響內切酶切點,使內切酶酶切片斷呈多態性。
一般采用Southern印跡雜交法檢測
培養細胞的污染問題及檢測
細胞培養的污染問題十分重要，一旦發生污染，將導致前功盡棄。所以細胞培養一定要建立無菌觀念。遇到培養污染要分析原因，及時處理。
細胞污染的種類和判定
細胞培養中常見的污染物有細菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現以下情況時培養的細胞可能有污染：
1) 培養液的酸堿度發生異常的改變。
2)培養液出現混濁。
3)光鏡觀察到菌絲和顆粒。
4)細胞出現死亡或增殖緩慢等。
污染物的檢測
1.細菌和真菌污染的檢測：
1）涂片染色鏡檢；
2）接種培養：Trypticase大豆肉湯、BHI、Thioglycocollate肉湯和血瓊脂板適于廣泛的細菌檢測；Sabouraud肉湯、YM肉湯和營養肉湯適于檢測真菌。
檢測到陽性結果后，應高壓滅菌處理污染的培養物及其用具。
2.支原體檢測:
支原體污染細胞后，能抑制細胞代謝和生長，改變核酸合成，影響細胞的抗原性，引起細胞染色體改變，干擾病毒的復制，以及具有類病毒作用。在培養細胞初期，由于支原體對細胞的繁殖影響較小而往往被忽略
支原體檢測方法和處理
1）熒光技術檢測：支原體含有DNA，能與一種熒光染料Hoechest 33258特異性的結合，可根據細胞表面的熒光來顯示細胞是否污染有支原體。
2）直接培養法：實驗室常用。
3）放射自顯影檢測：
4）DNA分子雜交：
檢測完畢后，所有實驗用具均應經過高壓消毒處理。
5）污染支原體后的處理：
v 抗生素處理：如加入泰樂菌素等。
v 共培養法：與巨噬細胞共培養。
v 重新克隆法：抗生素處理后，將細胞稀釋后傳代，每周換2次含抗生素的新鮮培養液，4~5周后，重復克隆2次。
v 過濾法：0.22µm孔徑濾膜正壓過濾。
污染病毒的檢測
1）致細胞病變效應（CPE）或集落的檢測：采用相差顯微鏡檢測
2）血細胞吸附試驗；
3）雞胚接種。
細胞間交叉污染
為避免細胞間交叉污染，應注意：
細胞保存
在體外培養工作中，常要將體外培養物進行冷凍保存，在需要時再復溫融解進行體外培養（復蘇）。要獲得好的凍存與復蘇效果，必須了解如下幾個問題：冷凍速率、復溫速率、冷凍保護劑，冷凍保存溫度。
1、 冷凍速率
冷凍速率是指降溫的速度，是活細胞能否被冷凍到一個能永久保存的溫度的一個主要因素。冷凍速率太快或太慢都會造成細胞的損傷，只有以最適的冷凍速率冷凍細胞，才能獲得最佳的冷凍保存效果。
不同細胞最適冷凍速率的值也有所不同，如小鼠骨髓干細胞、酵母、人紅細胞最適冷凍速度分別是1.6℃、7℃和200/分。所以一種細胞冷凍保存之前要測試出其最適冷凍速度，擬保證獲得最高冷凍存活率。
2、復溫速率
復溫速率是指細胞復蘇時溫度升高的速度。冷凍保存的細胞復蘇時，復溫速率不當也會降低冷凍存活率。一般來說復溫速度越快越好，37℃水浴中，1～2分鐘內要完成復溫。
3、冷凍保護劑
冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質，常被加到一定的溶液中進行配制，作為冷凍保護液。紅細胞、大多數微生物和極少數有核的哺乳類動物細胞懸浮在水或簡單的鹽溶液中而不加冷凍保護劑，以最適的冷凍速率冷凍保存可獲得活的凍存物。
v 對大多數有核哺乳類動物細胞來說，在不加冷凍保護劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的凍存物。
v 目前冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類。
v 具有滲透性的冷凍保護劑可以滲透到細胞內，一般是一些小分子的物質，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等，。
v 非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉等。
4、冷凍保存溫度
冷凍保存溫度是指能長久保存細胞的一個深低溫度。在這樣的溫度下，細胞生化反應極其緩慢或停止，但經長期保存和復蘇后仍能保持正常的結構和功能。從實際和效益的觀點出發，液氮溫度（﹣196℃）是目前最佳冷凍保存溫度。 |
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