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生物知識

鱟試驗檢查細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)注意的問題

作者:admin 來源:本站 發(fā)布時間: 2010-05-15 00:11  瀏覽次數(shù):
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周愛華(云南省楚雄州人民醫(yī)院藥劑科,楚雄675000)

摘要:目的:〖HTK〗探討影響鱟試驗準(zhǔn)確性的干擾因素和處理方法。方法:通過對干擾鱟試驗準(zhǔn)確性干擾因素的分析(包括鱟試劑本身、操作條件、配制原料等),提出了鱟試驗中應(yīng)注意的問題。結(jié)果:只要克服了檢查中的干擾因素,鱟法具有比家兔法更簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。結(jié)論:凡不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查或雖有干擾但可克服的注射劑藥品,均可用鱟法代替家兔法檢查其熱原。

關(guān)鍵詞:鱟試驗;熱原;家兔熱原檢查法;注意事項

中圖分類號:R92712文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B文章編號:1006-0111(2000)03-0162-02

    鱟試驗是利用鱟的變形細(xì)胞與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的現(xiàn)象,作為判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素限量是否符合規(guī)定的一種方法[1]。它具有比家兔法更簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。中國藥典1995年版已收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(簡稱鱟試驗),但只用于幾種輸液的檢查。根據(jù)現(xiàn)有的實驗證明,凡不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查或雖有干擾,但可以克服的藥品注射劑,將能夠全部以鱟法代替家兔熱原檢查法。但是該法受到許多因素的影響,故在做鱟試驗檢查時,應(yīng)注意下列問題。

1鱟試劑本身

1.1鱟試劑靈敏度為了保證檢查細(xì)菌內(nèi)毒素結(jié)果的準(zhǔn)確性,用于試驗的鱟試劑應(yīng)首先核對靈敏度。因為在我們的實際工作中,發(fā)現(xiàn)鱟試劑均符合藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)前提下,由于生產(chǎn)廠家不同,部分鱟試劑的實測靈敏度與標(biāo)示值有差異而導(dǎo)致檢測同一檢品時,用相同標(biāo)示值的鱟試劑,出現(xiàn)不同結(jié)果。因而先核對靈敏度可避免因鱟試劑本身造成的判斷失誤。建議法定部門和生產(chǎn)單位應(yīng)注意鱟試劑的質(zhì)量檢查。

1.2供試品稀釋在取樣品時,一定要熟悉中國藥典的內(nèi)容,不能直接取大輸液原液0.1ml進(jìn)行檢查,這是排除干擾因素的簡單有效的方法。因藥典已明確規(guī)定試驗中鱟試劑的靈敏度不超過0.5EU/ml,根據(jù)供試品的稀釋公式:供試品稀釋倍數(shù)=L/λυL:供試品的內(nèi)毒素限量(1EU/ml)λυ:鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值(EU/ml)故檢測大輸液均應(yīng)稀釋后才能進(jìn)行試驗,如選用更高靈敏度的鱟試劑,則應(yīng)增加樣品的稀釋倍數(shù)。稀釋用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水藥典作了規(guī)定。在4h內(nèi)不得與鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)。

    如果直接用供試品原液試驗,就會使供試品的內(nèi)毒素提高到0.5EU/ml或0.5EU/ml以下,這樣,根據(jù)目前大輸液的生產(chǎn)和貯藏條件,有些就會達(dá)不到,鱟法檢出的陽性率會提高,兔法復(fù)核的機(jī)遇也將增多,勢必會浪費(fèi)人力物力。

2操作條件

2.1操作熟練程度操作時嚴(yán)格按無菌操作法進(jìn)行,安瓿開啟前應(yīng)先用砂石劃痕(不管是色點或包環(huán)易折安瓿),用手半拉半掰將頸部折斷,防止碎玻屑掉入安瓿內(nèi)及有一個比較整齊的頸口。在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加入時,取樣均應(yīng)準(zhǔn)確量取。操作時,雙手避免在安瓿或試管的上方來回移動,加樣后迅速封閉管口,并立即放入恒溫水浴箱中,且整個操作過程中時間應(yīng)緊湊,防止微生物的污染,否則易致假陽性的出現(xiàn)。

2.2混合液的pH值供試液與鱟試劑混合液的pH值對鱟試驗的影響較大,根據(jù)國內(nèi)外資料的報道,試驗的最適pH為6.25~7.25才能形成最佳凝膠[2]。而藥典規(guī)定各種葡萄糖注射液的pH為3.2~5.5,我院控制在3.7~42之間。我們曾對pH值小于4.0的多批次葡萄糖注射液作了調(diào)pH和不調(diào)pH的比較試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該pH范圍內(nèi)兩者無顯著差異,不調(diào)pH者陰性抑制試驗仍可得到堅實的凝膠,說明不影響反應(yīng)靈敏度,且鱟試劑本身具有一定的緩沖能力。但pH值過大或過小均可抑制鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng),其原因可能是pH值過大或過小均可破壞極微量的內(nèi)毒素。

2.3保溫溫度將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成1EU/ml,進(jìn)行鱟試驗,然后分別放置于25、28、31、34、37、40、43、46、49℃水浴保溫。實驗中觀察到凝膠形成的速度隨著溫度的升高而加快,但到達(dá)49℃保溫90min也未出現(xiàn)凝膠。

    從實驗可以看出,溫度對鱟試劑的靈敏度影響很大,保溫溫度在25~40℃之間,隨著溫度的升高,鱟試劑的靈敏度亦增大,在40~46℃之間,溫度對鱟試劑的靈敏度無明顯影響,達(dá)到49℃或更高溫度時,則會破壞鱟試劑。故應(yīng)嚴(yán)格按照藥典的要求,溫度控制在(37±1)℃之間,才可獲得理想的結(jié)果。

2.4保溫時間將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成1EU/ml,進(jìn)行鱟試驗,37℃水浴保溫,分別在10、20、30、40、50、70min時觀察,發(fā)現(xiàn)凝膠形成的堅實狀態(tài)隨著時間的延長而堅固。

    從上述實驗可以看出,延長保溫時間,可以提高鱟試劑的靈敏度,增加假陽性。故應(yīng)遵守我國藥典規(guī)定的保溫(60±2)min時間。

2.5在鱟試驗過程中應(yīng)防止試管受到振動鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素形成的凝膠受到振動后易變形而誤判為陰性。因此,在鱟試驗過程中,不宜進(jìn)行容易引起試管振動的實驗操作,試驗用的試管架的眼孔直徑應(yīng)與安瓿或試管直徑相接近,避免安瓿或試管左右晃動。水浴箱要放置在固定不易受到振動的地方,保溫過程中不可隨時取出觀察。

3其它

3.1配制的原料在鱟試驗檢測中,0.9%氯化鈉注射液多次出現(xiàn)假陽性反應(yīng),對此進(jìn)行了實驗工作,查找原因,發(fā)現(xiàn)陽性率高與廠家原料有關(guān)。筆者把不同廠家生產(chǎn)的氯化鈉原料配制的0.9%氯化鈉注射液,對不能通過鱟法檢查的送藥檢所用兔法檢查,結(jié)果為陰性,其中個別廠家的陽性率高于其它廠家,為此將不同廠家的氯化的原料分別在230℃烘焙1h后進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)個別產(chǎn)品色澤明顯變黃。按中國藥典1995年版附錄規(guī)定的易炭化物檢查,分別將不同廠家的氯化鈉原料進(jìn)行易炭化物相對照檢查,結(jié)果上述明顯變黃廠家的氯化鈉色澤較深。因此認(rèn)為個別廠家的注射用氯化鈉原料含有較多的有機(jī)雜質(zhì),希望廠家要控制好質(zhì)量。另外,在葡萄糖原料中偶有存在著β-D聚葡糖的現(xiàn)象,它與鱟試劑發(fā)生凝集反應(yīng),但注入兔體內(nèi)不能使其升溫,故造成假陽性,所以最好是使用定點廠家合格的葡萄糖原料。

3.2所用器皿均應(yīng)徹底洗凈和滅菌安全實驗用器皿均應(yīng)充分洗滌并沖洗干凈,特別是接觸酸堿或用洗衣粉、洗液等洗滌后,更應(yīng)沖洗干凈,以免殘留物破壞極微量的內(nèi)毒素。滅菌應(yīng)按藥典中的有關(guān)方法處理,防止引入外源性內(nèi)毒素。如有條件的話可用合格的細(xì)菌內(nèi)毒素快檢盒。

3.3陽性對照我國藥典規(guī)定鱟試驗必須做陽性對照,其目的就是證實實驗條件下鱟試劑的活性,所以在實驗過程中,陽性對照如為陰性,此次試驗無效,應(yīng)重新復(fù)做。另外細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)稀釋,不可放置后再用。

參考文獻(xiàn):

[1]王茂林鱟試劑法檢查熱原的應(yīng)用范圍[J]中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,1990,10(1):41

[2]高國政,顏錦pH值影響細(xì)菌內(nèi)毒素測定的實驗室研究[J]中國藥學(xué)雜志,1998,33(3):162

收稿日期:1999-11-29
 

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